כימות עומס הליקובקטר פילורי בקיבת עכבר נגוע

תקציר

מקור: D'Costa, K. et al., Mouse מודלים של זיהום הליקובקטר ופתולוגיות קיבה. J. Vis. Exp. (2018)

בסרטון זה, אנו מתארים פרוטוקול לכימות עומס הליקובקטר פילורי ברקמות קיבה של עכבר לאחר הדבקה כדי לאשר את הנשאות שלו.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. אישור התיישבות חיידקים בקיבה לאחר ההדבקה

1. ספירה בת קיימא של H. pylori בקיבה
   1. יש להשלים צלחות HBA סטריליות עם אנטיביוטיקה נוספת (200 מיקרוגרם/מ"ל בציטרסין ו-10 מק"ג/מ"ל חומצה נאלידיקסית) לפני ביצוע ספירת מושבות מקיבות עכברים נגועות.
   2. הומוגניזציה של חלקי קיבה באופן ידני, באמצעות פוליפרופילן מיקרו מזיקים הניתנים להרכבה, או באמצעות מכשיר דיסוציאציה מכני (ראה טבלת חומרים).
   3. הכינו דילולים סדרתיים כפולים (^10-1 עד ^10-2) של הומוגנאטים בקיבה המתקבלים ב-BHI.
      סטרילי הערה: יש להחליט על דילול בהתבסס על עומסי החיידקים האופייניים המתקבלים עבור זן H. pylori נתון המשמש לזיהום, כמו גם משך ההדבקה. ניתן להשתמש גם בדגימות לא מדוללות.
   4. חלקו לוחות HBA מיובשים מראש (הערה: על מנת להבטיח בידוד של מושבות בודדות, יש לחמם ולייבש את לוחות HBA בארון בטיחות ביולוגי או באינקובטור של 37°C למשך 10-15 דקות לפני השימוש.) לשלושה או ארבעה מקטעים. באמצעות עיבוד של טכניקת מיילס ומצרה, מוסיפים 10-100 מ"ל מכל דילול על קטע של צלחת האגר ומורחים באמצעות לולאות פלסטיק סטריליות.
   5. הניחו לצלחות להתייבש ולאחר מכן הניחו אותן במצב הפוך (צד המכסה כלפי מטה) בצנצנות גז אנאירוב. כדי לשמור על לחות בצנצנות, יש לכלול צלחת פטרי המכילה מים.
   6. דוגרים על צנצנות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד להיווצרות מושבות (בדרך כלל 4-7 ימים).
   7. ספירת מקטעים המכילים בין 10 ל-100 מושבות מבודדות.
      הערה: ניתן להבדיל בין מושבות H. pylori ו-H. felis על צלחות לבין אלה של חברים אחרים במיקרוביוטה של הקיבה של מורין באמצעות בדיקות סטנדרטיות של אוריאז, קטלאז ואוקסידאז. H. pylori ו- H. felis חיוביים לכל שלוש הבדיקות.
   8. חשב את עומסי החיידקים כ- (CFU/g של רקמה), באמצעות הנוסחה הבאה:
      [(מספר המושבות הממוצע שנספר) × (גורם דילול) x (מצופה נפח)]/(משקל קיבה).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים בקטריולוגיים
בסיס אגר דם אוקסואידי מס '2	תרמו פישר סיינטיפיק	CM0271B	יש להמיס במים שעברו דה-אינוניזציה לפני העיקור
דם סוס פרימיום דפיברין	ביולוגים אתיים אוסטרליים	PDHB100
מרק עירוי לב Bacto למוח	BD Bioscience	237500	יש להמיס במים שעברו דה-אינוניזציה לפני העיקור
חבילות גז CampyGen	תרמו פישר סיינטיפיק	CN0035A/CN0025A
אנטיביוטיקה
ונקומיצין	סיגמא אולדריץ'	V2002-1G	מתמוססים במים שעברו דה-יוניזציה
פולימיקסין B	סיגמא אולדריץ'	P4932-5MU	מתמוססים במים שעברו דה-יוניזציה
טרימטופריים (≥98% HPLC)	סיגמא אולדריץ'	T7883	להתמוסס באתנול 100% (מוחלט)
אמפוטריצין	אמרסקו (אסטרל סיינטיפיק)	E437-100MG	מתמוססים במים שעברו דה-יוניזציה
Bacitracin מ Bacillus licheniformis	סיגמא אולדריץ'	B0125	מתמוססים במים שעברו דה-יוניזציה
חומצה Naladixic	סיגמא אולדריץ'	N8878	מתמוססים במים שעברו דה-יוניזציה
ציוד וכלי פלסטיק
צנצנות אנאירוביות אוקסואיד	תרמו פישר סיינטיפיק	HP0011/HP0031
פיפטות קופאן פסטר	שירותי Interpath	200CS01
צנטריפוגת אפנדורף 5810R			איסוף כדורי חיידקים באמצעות צנטריפוגה ב-2,200 סל"ד למשך 10 דקות ב-4°C
פארפילם מ	Bemis, VWR	PM996
Eppendorf micropestle עבור 1.2 - 2 מ"ל צינורות	סיגמא אולדריץ'	Z317314	מזיקים פוליפרופילן autoclavable המשמשים הומוגניזציה בקיבה
GentleMACs Dissociator	Miltenyi ביוטק	130-093-235	השתמש בתוכניות gentleMACS מוגדרות מראש עבור רקמת קיבה של עכבר
צינורות M (כובע כתום)	Miltenyi ביוטק	30-093-236
פלואורומטר קיוביט	תרמו פישר סיינטיפיק	Q33216
לולאת פלסטיק סטרילית	LabServ	LBSLP7202