צנתור דרך השופכה וחיסון חיידקי ליצירת מודל דלקת בדרכי השתן בעכברים זכרים

תקציר

מקור: Zychlinsky Scharff, A., et al. דלקת בדרכי השתן במודל של חיה קטנה: צנתור טרנס-שופכתי של עכברים זכרים ונקבות. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום Escherichia coli אורופתוגני בשלפוחית השתן של עכבר נקבה באמצעות החדרת קטטר טרנס-שופכתי. החיידקים המוזרקים מצליחים לבסס זיהום בדרכי השתן בתוך שלפוחית השתן, ומספקים פלטפורמה רבת ערך לחקר מחלות הקשורות לבריאות הקשורות לדרכי השתן.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צנתרים

1. הכינו צינורית אחת לגישה תוך-ורידית בילדים עבור כל קבוצת עכברים שתידבק. באמצעות מנגנון הקפיץ המובנה, מוציאים כל צינורית מהמחט שלה, לפי הוראות היצרן. השליכו את המחטים, ושמרו רק על צינורית הפלסטיק בעירוי.
2. יש לעקר צנתרים במכסה מנוע זרימה למינרית למשך מחזור אולטרה סגול אחד (U.V.), בדרך כלל 25 - 30 דקות
   הערה: ניתן להשתמש בצנתרים עבור יותר מעכבר אחד, עם זאת, יש להשתמש בצנתר חדש בין קבוצות ניסוי, מינים או זני חיידקים.

2. הכנת E. coli אורופתוגני לזיהום

1. לפחות יומיים לפני ההדבקה, באמצעות לולאת חיסון סטרילית, פזרו UPEC ממלאי חיידקים קפואים על צלחת אגר של ציר לוריא (LB), המכילה אנטיביוטיקה במידת הצורך. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C עד שבוע אחד.
2. בצלוחית Erlenmeyer סטרילית של 100 מ"ל, יש לחסן 10 מ"ל LB, המכיל אנטיביוטיקה במידת הצורך, עם מושבה אחת מצלחת LB ולדגור על 37°C למשך הלילה (כ-16 - 18 שעות).
   הערה: תרביות עמידה מאפשרות ביטוי של פילי מסוג 1, הנחוצים לזיהום. תרביות שגדלו רועדות יהיו בעלות ביטוי פילי פחות יעיל, ולכן שיעורי הדבקה לא עקביים.
3. למדוד את הצפיפות האופטית (OD)₆₀₀ של תרבית הלילה ולחשב את מספר החיידקים למ"ל באמצעות עקומת גדילה שנקבעה מראש. לדוגמה, עבור זן UPEC UTI89, OD₆₀₀ = 0.35 שווה ערך ל- 2 x 10⁸ CFU למ"ל, ולכן, תרבית לילה עם OD₆₀₀ = 2.4 תהיה שוות ערך ל- 13.7 x 10⁸ CFU למ"ל. לקבוע אמפירית את הקשר בין OD₆₀₀ לבין חיידקים בני קיימא עם כל זן חדש המשמש לזיהום.
4. לקבוע את כמות החיידקים הדרושה על ידי התחשבות במספר בעלי החיים להיות נגועים וכי כל עכבר צריך לקבל כ 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (CFU) ב 50 μl PBS. כלול בחישוב את ~ 130 μl נפח מת של קטטר ומזרק nub ו 100 μl הדרוש כדי לקבוע את החיסון.
   1. סובב את התרחיף החיידקי במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במהירות של 17,000 x גרם למשך דקה אחת והשהה מחדש את כדורית החיידקים המתקבלת ב- 2 x 10⁸ CFU למ"ל ב- PBS. לדלל באופן סדרתי aliquot של תרחיף זה צלחת אותו על LB אגר, עם אנטיביוטיקה במידת הצורך, כדי לקבוע את החיסון המדויק עבור כל זיהום.
5. ציירו את החיסון החיידקי לתוך מזרק של 1 מ"ל וחברו את הצנתר לקצה המזרק. הקש על המזרק כדי להסיר אוויר ולחץ על הבוכנה כדי למלא את חלל האוויר המת בצנתר לפני תחילת ההחדרה.

3. הכנת עכברים

1. מרדימים עכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין. ניתן לספק חימום נוסף.
2. ודא שכל עכבר מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על כרית כף הרגל בלחץ בינוני. עכברים מורדמים לחלוטין כאשר הם אינם מגיבים ודורשים 3 - 5 דקות כדי להגיע למצב זה.
3. הניחו עכברים בשכיבה והפעילו לחץ בינוני על הבטן התחתונה כדי לרוקן את שלפוחית השתן משתן. שלפוחית מלאה מרגישה כמו אפונה מתחת לעור בין פסגות האיליאק.
   הערה: איזופלורן בשאיפה שימש לצנתור עכברים נקבות, עם זאת, לא נבדק אם עכברים זכרים מורדמים מספיק על ידי איזופלורן בשאיפה לצורך הליך זה.

4. החדרת השופכה של עכברים זכרים

1. הניחו שתי מלקחיים אגודל בצורה גולגולתית וקאודלית על איבר המין החיצוני של העכבר. משוך את prepuce כדי לחשוף באופן מלא את פין העטרה. ברגע שהפין ממוקם חיצונית, שחררו את המלקחיים באגודל.
2. מקם מחדש את המלקחיים כדי לייצב את הפין הבולט בניצב לחיה, מחזיק את האיבר בעדינות אך בעדינות. דמיינו את בשר השופכה והכניסו בזהירות את הצנתר לפתח הקטן בקצה האיבר. יש להנחות בעדינות את הצנתר לתוך הפין, לכיוון גוף העכבר, תוך שמירה על מתח עדין עם המלקחיים. הצנתר אינו דורש שימון. אין להכריח את הצנתר לתוך הפין; הצנתר צריך להחליק בצורה חלקה לתוך השופכה, המציין מיקום נכון.
3. ברגע שהרכזת של הצנתר פוגשת את קצה הפין, לאט מאוד להוציא 50 μl של החיסון, תוך שמירה על המיקום של הפין. ניתן לציין את איכות ההחדרה בשלב זה על פי ציון איכות החדרה שנקבע מראש, כמו זה המוצג באיור 1.
4. הוציאו את הצנתר באיטיות, מעל ספירה של 5, כדי למנוע דליפה של החיסון. הניחו עכברים בכלובים שלהם במצב שכיבה. בעלי חיים צריכים להתחיל להתאושש 30 - 45 דקות לאחר ניהול של הרדמה.

תוצאות

איור 1: איכות ההחדרה אינה מתואמת עם עומס חיידקי 24 שעות לאחר ההדבקה. לעכברי C57Bl/6 נקבות וזכרים בני שישה עד 8 שבועות הוחדרו 10⁷ CFU של UPEC. מיד לאחר כל החדרה, חוקר יחיד הקצה ציון איכות להחדירה, כפי שהוגדר על ידי קריטריונים ספציפיים (טקסט בתיבה). 24 שעות לאחר ההדבקה, שלפוחית השתן הוסרה באופן אספטי כדי למנות עומס חיידקי. העלילה מתארת את ציון האיכות שהוקצה לעומת CF...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צנתרי IV מסוככים BD Insyte Autoguard 24 G, קוטר חיצוני 0.7 מ"מ, אורך 14 mM	BD מדיקל	381811 או 381411*	* המספר הקטלוגי תלוי במדינה
לולאת חיסון	גריינר ביו-וואן	731171
מזרקים	בי בראון	9166017V
אגודל (אדסון) מלקחיים	כלים מדעיים משובחים	11006-12
מזרק אינסולין	תרומו	BS05M2913
5 מ"ל צינורות, פוליפרופילן	בז	352063
מרק ל.ב. מילר	דיפקו	244620
ל.ב. מילר אגר	דיפקו	244520
קובטות	ביו-ראד	223-9955