הקמת מודל של דלקת בדרכי השתן בעכברות

תקציר

מקור: Zychlinsky Scharff, A. et al., דלקת בדרכי השתן במודל של חיה קטנה: צנתור Transurethral של עכברים זכרים ונקבות.J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום Escherichia coli אורופתוגני בשלפוחית השתן של עכבר נקבה באמצעות החדרת קטטר טרנס-שופכתי. החיידקים המוזרקים מצליחים לבסס זיהום בדרכי השתן בתוך שלפוחית השתן, ומספקים פלטפורמה רבת ערך לחקר מחלות הקשורות לבריאות הקשורות לדרכי השתן.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת צנתרים

1. הכינו צינורית אחת לגישה תוך-ורידית בילדים עבור כל קבוצת עכברים שתידבק. באמצעות מנגנון הקפיץ המובנה, מוציאים כל צינורית מהמחט שלה, לפי הוראות היצרן. השליכו את המחטים, ושמרו רק על צינורית הפלסטיק בעירוי.
2. יש לעקר צנתרים במכסה מנוע זרימה למינרית למשך מחזור אולטרה סגול אחד (U.V.), בדרך כלל 25 - 30 דקות
   הערה: ניתן להשתמש בצנתרים ליותר מעכבר אחד, אולם יש להשתמש בצנתר חדש בין קבוצות ניסוי, מינים או זני חיידקים.

2. הכנת Escherichia coli אורופתוגני לזיהום

1. לפחות יומיים לפני ההדבקה, באמצעות לולאת חיסון סטרילית, פזרו Escherichia coli אורופתוגני (UPEC) ממאגר חיידקים קפואים על צלחת אגר של ציר לוריא (LB), המכילה אנטיביוטיקה במידת הצורך. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה. ניתן לאחסן צלחות ב 4 ° C עד שבוע אחד.
2. בצלוחית Erlenmeyer סטרילית של 100 מ"ל, יש לחסן 10 מ"ל LB, המכיל אנטיביוטיקה במידת הצורך, עם מושבה אחת מצלחת LB ולדגור על 37°C למשך הלילה (כ-16 - 18 שעות).
   הערה: תרביות עומדות מאפשרות ביטוי של פילי מסוג 1, הנחוצים לזיהום. תרביות שגדלו רועדות יהיו בעלות ביטוי פילי פחות יעיל, ולכן שיעורי הדבקה לא עקביים.
3. למדוד את הצפיפות האופטית (OD)₆₀₀ של תרבית הלילה ולחשב את מספר החיידקים למ"ל באמצעות עקומת גדילה שנקבעה מראש. לדוגמה, עבור זן UPEC UTI89, OD₆₀₀ = 0.35 שווה ערך ל- 2 x 10⁸ יחידת יצירת מושבה (CFU) למ"ל, ולכן, תרבית לילה עם OD₆₀₀ = 2.4 תהיה שוות ערך ל- 13.7 x 10⁸ CFU למ"ל. לקבוע אמפירית את הקשר בין OD₆₀₀ לבין חיידקים בני קיימא עם כל זן חדש המשמש לזיהום.
4. לקבוע את מספר החיידקים הדרוש על ידי התחשבות במספר בעלי החיים להיות נגועים וכי כל עכבר צריך לקבל כ 10⁷ יחידות יוצרות מושבה (CFU) ב 50 μl פוספט buffered מלוחים (PBS). כלול בחישוב את ~ 130 μl נפח מת של קטטר ומזרק nub ו 100 μl הדרוש כדי לקבוע את החיסון.
   1. סובב את התרחיף החיידקי במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במהירות של 17,000 x גרם למשך דקה אחת והשהה מחדש את כדורית החיידקים המתקבלת ב- 2 x 10⁸ CFU למ"ל ב- PBS. לדלל באופן סדרתי aliquot של תרחיף זה צלחת אותו על LB אגר, עם אנטיביוטיקה במידת הצורך, כדי לקבוע את החיסון המדויק עבור כל זיהום.
5. ציירו את החיסון החיידקי לתוך מזרק של 1 מ"ל וחברו את הצנתר לקצה המזרק. הקש על המזרק כדי להסיר אוויר ולחץ על הבוכנה כדי למלא את חלל האוויר המת בצנתר לפני תחילת ההחדרה.

3. הכנת עכברים

1. מרדימים עכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית של 100 מ"ג/ק"ג קטמין ו-5 מ"ג/ק"ג קסילזין. ניתן לספק חימום נוסף.
2. ודא שכל עכבר מורדם לחלוטין על ידי לחיצה על כרית כף הרגל בלחץ בינוני. עכברים מורדמים לחלוטין כאשר הם אינם מגיבים ודורשים 3 - 5 דקות כדי להגיע למצב זה.
3. הניחו עכברים בשכיבה והפעילו לחץ בינוני על הבטן התחתונה כדי לרוקן את שלפוחית השתן משתן. שלפוחית מלאה מרגישה כמו אפונה מתחת לעור בין פסגות האיליאק.
   הערה: איזופלורן בשאיפה שימש לצנתור נקבות עכברים, עם זאת, לא נבדק אם עכברים זכרים מורדמים מספיק על ידי איזופלורן בשאיפה לצורך הליך זה.

4. החדרת השופכה של נקבות עכברים

1. בעזרת היד הלא דומיננטית, הניחו את האגודל על הזנב ואצבע של אותה יד על בטן העכבר והפעילו לחץ עדין בכיוונים מנוגדים כדי להחזיק את העכבר בחוזקה במקומו.
2. מניחים את קצה הצנתר בניצב לעכבר בפתח השופכה. בלחץ עדין, החליקו את הצנתר לתוך השופכה, עד שהרכזת תפגוש את פתח השופכה, ובמקביל הורידו את המזרק כך שיהיה מקביל למשטח העבודה. הצנתר אינו דורש שימון. אין לדחוף או לדחוף את הצנתר לתוך השופכה. הצנתר אמור להחליק בצורה חלקה וקלה לתוך השופכה, עם התנגדות מועטה או ללא התנגדות.
   1. לפני החדרת החיסון (שלב 4.3), ברגע שהקטטר נמצא במקומו, משכו בעדינות רבה את עור הבטן לכיוון ראש העכבר עם האצבע מהיד הלא דומיננטית שכבר נמצאת על בטנו של העכבר (שלב 4.1). אם הצנתר נמצא בשופכה, הרקמה המרכיבה את פתח השופכה לא תזוז, ואילו אם הצנתר ממוקם בצורה שגויה בנרתיק, הרקמה תזוז למעלה והרחק מהקטטר. בדיקה מהירה זו צריכה להתבצע על כל עכבר.
3. כאשר רכזת הצנתר פוגשת את פתח השופכה, מוציאים לאט 50 מיקרוליטר של החיסון החיידקי. קצב החדרה איטי ממזער ריפלוקס שלפוחית לתוך הכליה. הוציאו את הצנתר באיטיות כדי למנוע דליפה, מעל ספירה של 5. הניחו עכברים בכלובים שלהם במצב שכיבה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BD Insyte Autoguard Shielded IV צנתרים 24G, קוטר חיצוני 0.7 מ"מ, אורך 14 mM	BD מדיקל	381811 או 381411*	* המספר הקטלוגי תלוי במדינה
לולאת חיסון	גריינר ביו-וואן	731171
מרק ל.ב. מילר	דיפקו	244620
ל.ב. מילר אגר	דיפקו	244520
קובטות	ביו-ראד	223-9955
מזרקים	בי בראון	9166017V
מזרק אינסולין	תרומו	BS05M2913