$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הביקורת הווטרינרית JoVE.
1. ניתוח ציטומטרי זרימה של רקמת שלפוחית השתן
- הכינו חיץ עיכול המכיל collagenase ב-34 יחידות/מ"ל ו-DNase ב-100 מיקרוגרם/מ"ל, ב-PBS. שמור על קרח. הכינו צינור חרוטי אחד של 15 מ"ל לכל בעל חיים לניתוח ו-aliquot 1 מ"ל חיץ עיכול לכל צינור.
- בנקודות זמן קבועות מראש, יש להקריב עכברים באמצעות נהלי ניתוח סטנדרטיים מאושרים (למשל, פריקת צוואר הרחם או מנת יתר של פחמן דו חמצני). יש להרטיב היטב את הבטן עם 70% אתנול כדי למזער את הזיהום על ידי הפרווה.
- בצע חתך בשליש התחתון של בטנו של העכבר של לפחות 2 ס"מ באמצעות מספריים והסר את שלפוחית השתן כולה. טחון היטב עם מספריים, לחתוך את שלפוחית השתן לתוך 2 - 3 מ"מ2 חתיכות גודל, בדרך כלל על 8 חתיכות.
- יש להוסיף שלפוחית טחון אחת לכל צינור המכיל חיץ עיכול. יש לנער כדי לשטוף רקמת שלפוחית טחון לתוך מאגר העיכול. יש לשמור על קרח עד שכל שלפוחית השתן נחתכת וטחונה.
- יש לדגור על שלפוחיות טחונות במשך 60 - 75 דקות בטמפרטורה של 37°C, עם טלטול ידני נמרץ במשך 5 שניות כל 15 דקות. כאשר הרקמה בעלת מראה זכוכית שקוף, הדומה לנייר טישו רטוב, העיכול הושלם. עיכול ממושך יסיר חלבונים על פני השטח מהתאים הדרושים לזיהוי ויש להימנע מהם.
- נטרלו את אנזימי העיכול על ידי הוספת 2-3 מ"ל של חיץ ציטומטריה של זרימה קרה כקרח (PBS המכיל 2% נסיוב בקר עוברי (FBS) ו-0.2 mM EDTA) וערבבו בעדינות. מניחים צינורות על קרח.
- כדי להבטיח תרחיף חד-תאי ולהסיר רקמת חיבור, העבירו את תכולת הצינור דרך מסנן של 100 מיקרומטר הממוקם בצינור חרוטי של 15 מ"ל. לחץ בעדינות על כל הרקמה שנותרה דרך המסנן עם קצה בוכנה מזרק. שטפו את המסנן עם מאגר ציטומטריה נוסף של זרימה של 2 מ"ל. יש לשמור את הדגימות על קרח.
- יש לשטוף דגימות באמצעות צנטריפוגה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 200 x גרם, 4°C. יש להשהות מחדש את כדורי ההשהיה במאגר ציטומטריית זרימה של 100 μL המכיל בלוק Fc, מדולל ל-5 מיקרוגרם/מ"ל, ולהעביר לצלחת תחתונה עגולה של 96 בארות. לאחר 10 - 15 דקות, להוסיף 100 μL קוקטייל נוגדנים הרצוי לכל דגימה. דגירה על דגימות במשך 30 - 45 דקות, על קרח, מוגן מפני אור.
הערה: בלוק Fc הוא מגיב המשמש למניעת קשירה של חלק Fc של נוגדנים לתאים המבטאים קולטני Fc. מטרתו היא למזער קשירת נוגדנים לא ספציפיים. קביעת הנוגדנים לשימוש תהיה תלויה בהשערה הנבחנת בניסוי ויש לבחור אותה עם קלט מהספרות. באיור 1, כדי למדוד את החדירה הכוללת של תאי מערכת החיסון, נעשה שימוש בנוגדן נגד CD45, שהוא חלבון תאי פאן-חיסוני.
- יש לשטוף דגימות באמצעות צנטריפוגה למשך 7 דקות בטמפרטורה של 200 x גרם, 4°C. יש להשהות מחדש את כדורי התא במאגר ציטומטריית זרימה של 200 μL ולהעביר דגימות דרך מסננת תאים של 40 מיקרומטר על צינור פוליסטירן של 5 מ"ל ממש לפני הרכישה על ציטומטר זרימה.
- אספו את כל הדגימה על ציטומטר הזרימה. עיכול טוב יניב 200,000 - 400,000 תאים, עם 8,000 - 10,000 תאי חיסון CD45+ משלפוחית השתן התמימה של עכברים, בעוד שאיברים נגועים יכילו יותר תאים (איור 1).
הערה: לא ניתן להשתמש בדגימות שהוכנו לניתוח ציטומטרי של זרימה כדי להעריך CFU. לא מומלץ לפצל את שלפוחית השתן לשני חלקים מכיוון שלא קיימות ראיות המוכיחות כי נשאות אי קולי אורופתוגני (UPEC) או חדירת תאי מערכת החיסון אחידה בכל הרקמה.
