טכניקה לביסוס מודל זיהום חיידקי בתרבית איברים Ex Vivo

תקציר

מקור: Rizzuto, G. A., et al. תרביות שליה ואיברים נשירים אנושיים לחקר זיהומים בממשק האם-עובר. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים שיטה להקמת מודל זיהום ברקמות השליה לחקר התפשטות זיהום. תרבית איברי שליה ex vivo נגועה בליסטריה מונוציטוגנים, טפיל תוך-תאי פקולטטיבי. החיידקים פולשים לטרופובלסטים חיצוניים (EVTs) כדי להיכנס לרקמת השליה ואז להתפשט לתאים אחרים באמצעות התפשטות תא לתא.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת לוחות תרבית איברים

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים בטכניקה סטרילית בתרבית רקמה. זה אידיאלי עבור המיקרוסקופ לנתח להיות ממוקם בשדה סטרילי. עם זאת, זה לא הכרחי לחלוטין כל עוד micro-dissection מבוצע במהירות, מכשירים טבולים לעתים קרובות 70% אתנול.

1. הפשירו בקבוקונים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) על קרח. לדלל את ECM 1:1 עם מדיה איסוף קר כקרח, ולערבב על ידי pipetting. פיפטה לאט כדי למנוע החדרת בועות. כל באר של צלחת תרבית רקמה בעלת 6 בארות דורשת 100 מיקרוליטר של תרחיף זה ותתאים ל-3-4 תרביות איברים.
2. הניחו תוספות טרנסוול (גודל נקבוביות 0.4 מיקרומטר) לכל באר של צלחת תרבית הרקמה בעלת 6 הקידוחים.
3. יש לצפות כל תוסף טרנסוול בשכבה דקה (100 μl) של מתלה ECM/מדיה.
4. מניחים את הצלחת על קרח ומיד ממשיכים להקמת תרבויות איברים. לחלופין, הכינו את הצלחת לפני איסוף הרקמות, ובמקרה כזה עטפו אותה בסרט פארא-פילם ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C לשימוש מאוחר יותר. אחסון ארוך מ-6 שעות אינו מומלץ מכיוון שה-ECM יתייבש.

2. כינון תרבויות איברים

הערה: שלב זה מתאר כיצד למקם תרביות איברים נשירים ותרביות איברים וילוס בטרנסוולים נפרדים. הרקמות אינן במגע. חוקרים המעוניינים בטכניקת תרבות משותפת שבה דסידואה ווילי נמצאים בקשר ישיר זה עם זה יכולים להפנות לספרות קודמת.

1. יש לשטוף את הדגימות פעמיים באמצעי האיסוף ולצנטריפוגה בגודל 1,000 x גרם בין כל שטיפה. מעבירים רקמה לצלחת פטרי סטרילית ומניחים אותה על במת מיקרוסקופ מנתח. יש לשמור צלחת בת 6 בארות על קרח צמוד למיקרוסקופ.
2. רקמת מיקרו-חתך עם ספרינגר סטרילי לניתוח מספריים ומלקחיים, כדי לבסס תרביות איברים של 2-3 מ"מ (איור 1A).
   הערה: תרביות איברים וילוס הן "עצים" קטנים, וסקולריים היטב עם 2 או 3 ענפים, ועם עמודות תא טרופובלסט אקסטרוויליות (EVT) בולטות. חשוב להשתמש רק ברקמת וילוס מדגימות השליש הראשון של <9 שבועות, שכן פלישה של טרופובלסטים אקסטרה-וויליים ל-ECM בולטת ביותר בגילאים צעירים אלה.
3. בחר וילי וסקולרי היטב עם עמודות תא EVT בולטות. עמודות תא EVT מוצגות כקצוות בולבוסיים, "מטושטשים", "רכים" (ראו ראשי חץ באיור 1A).
4. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר 3 או 4 עצים ויליים לתוך כל טרנסוול. כוונן ענפים כך שהעץ ימוקם שטוח על גבי ECM והפרד ענפים גושים.
5. מיקרו-לנתח רקמה נשירית עם ספריים סטריליים לניתוח מספריים ומלקחיים, כדי לבסס תרביות איברים נשירים 3 מ"מ³ (איור 1A).
   הערה: הדגימות מכילות שני סוגים שונים של רקמות נשירות, decidua parietalis ו-decidua capsularis (שברי רקמה שמאלית וימנית, בהתאמה, איור 1A).
6. חתוך עם מספריים כדי ליצור 3 מ"מ³ חתיכות של decidua parietalis. Decidua capsularis אינו משמש עבור תרבויות אלה. השתמש במלקחיים כדי להקניט כל דם אימהי קרוש
.
7. השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר 3-4 חתיכות של decidua לתוך כל transwell.
8. מוסיפים 1 מ"ל של מדיית איסוף לתחתית הבאר. יש לדגור על הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ב-5% CO₂.
9. לניסויים שבהם חשוב לחקות מתח חמצן תקין בשליה בשליש הראשון, יש לשמור על תרביות איברים בהיפוקסיה יחסית (3% O₂).
   הערה: אפשרויות מעבדה כוללות תאי אינקובטור היפוקסיה קטנים המשתלבים בתוך אינקובטורים קיימים או אינקובטור תלת גזי המציג גז N₂ חיצוני כדי להוריד את ריכוז החמצן.
10. יש להוסיף 1 מ"ל של מדיום וילוס או עשרוני (טבלה 1) לחלק העליון של הטרנסוול לאחר 12-16 שעות של תרבית.
    הערה: היעדר מדיה במהלך הלילה הראשון בתרבית מאפשר לעמודות תאי הטרופובלסטים החיצוניים לפלוש (תרבית וילוסית), ולרקמה (הן וילית והן נשירית) להיות מוטמעת היטב ב- ECM. מניסיוננו, תרביות איברים נשירים נשארות בנות קיימא למשך 72 שעות ותרביות איברים נשירים למשך 96 שעות. אנו ממליצים על נקודות קצה ניסיוניות הנמצאות במסגרת זמן זו. ראו טבלה 1 להרכב התווך הווילוסי והעשרוני. בתווך הוורילי יש אחוז גבוה של FBS, ואילו בתווך העשרוני מתווספים הורמוני הריון (פרוגסטרון, 17β-אסטרדיול) השומרים על המצב הנשירי (טבלה 1).

3. הכנת L. monocytogenes תרבויות

הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על אחסון לטווח ארוך של מונוציטוגנים L. , ואת התרבות והצמיחה של אורגניזם זה במרק לב המוח (BHI) מרק אגר, אנא עיין וואנג ואחרים.

1. בחרו מושבה בודדת של L. monocytogenes מתוך צלחת אגר BHI מפוספסת וחסנו 3 מ"ל של ציר BHI.
2. לדגור על תרבית L. monocytogenes במשך הלילה (16 שעות), במצב נטוי, ב 30 ° C.
   הערה: תנאי תרבית אלה מאפשרים לצמיחת חיידקים להגיע לשלב הנייח. L. monocytogenes הוא flagellated ב 30 ° C, אשר מגביר את הפלישה התא המארח.

4. זיהום של תרביות איברים עם מונוציטוגנים L.

1. מלוחים חוצצי פוספט חמים (PBS) ובינוניים וילוס או עשריריים (טבלה 1) עד 37°C.
2. השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להסיר את כל פיסות תרבית האיברים שלא פלשו ל-ECM, ולכן צפות בבאר.
3. שאפו בזהירות את המדיה מתחתית הטרנסוול. יש לשטוף את הטרנסוולים העליונים והתחתונים פעמיים על ידי הזרמה עדינה של 1 מ"ל PBS חמים לתוך הבאר, ולשאוף בזהירות בין לבין. פיפטה עדינה 1 מ"ל של מדיה וילוס או דצידואלית ללא אנטיביוטיקה לטרנסוול העליון והתחתון. היזהר לא להפריע לתרבות האיברים.
4. תן לרקמה לדגור במדיה נטולת אנטיביוטיקה למשך שעה לפחות כדי לוודא שהאנטיביוטיקה הוסרה.
   הערה: בשלב הנייח, צפיפות תרבית L. monocytogenes היא בערך 1 x 10⁹ יחידות יוצרות מושבה (CFU) למ"ל. מספר החיידקים המשמשים להדבקת תרביות איברים צריך להיקבע אמפירית כדי לענות על צרכי הניסוי.
5. עבור מונוציטוגנים מסוג בר, ניסויי זיהום שגרתיים מראים פלישה חזקה עם דילול של 1:50 של הלילה (4 x 10,⁷ L. monocytogenes ב 1 מ"ל של מדיה לכל באר). יש להשהות מחדש את מספר החיידקים המתאים בתווך נטול אנטיביוטיקה או דצידואלי.
6. שאפו מדיה מראש טרנסוולים. בעדינות להוסיף 1 מ"ל של inoculum. יש לדגור על צלחות בטמפרטורה של 37°C ב-5%_CO2 כדי לאפשר פלישת חיידקים.
7. הסר חיידקים חוץ-תאיים על-ידי שאיפת מדיה מבארות עליונות ותחתונות. יש לשטוף את הבארות פעמיים עם PBS חם. יש להוסיף 1 מ"ל של חומר להכנת Villous או Decidual בתוספת 50 מיקרוגרם ^ml-1 Gentamicin. דגירה על צלחות ב-37°C ב-5% CO₂.
   הערה: ל. מונוציטוגנים הוא חיידק תוך-תאי פקולטטיבי שיכול לגדול בתווך חוץ-תאי, לגדול בתוך תאים ולהתפשט מתא לתא מבלי לגשת לחלל החוץ תאי. Gentamicin יש השפעה חיידקית על L. monocytogenes תאיים, ולכן מאפשר מדידה של L. monocytogenes תוך תאי צמיחה והתפשטות דרך תרבית איברים.
   הערה: זיהום L. monocytogenes ניתן לשחזור של תרביות איברים villous ו decidua מתרחשת עם 5 שעות דגירה. ניתן לשנות את זמן הדגירה לפני הוספת גנטמיצין בהתבסס על צרכי הניסוי ויכולתו של האורגניזם לפלוש לרקמה. כדי להבין טוב יותר את האתרים האנטומיים הפגיעים ביותר לזיהום, ניתן להשתמש בזמני דגירה קצרים יותר.
8. שמור על לוחות ב 37 ° C ב 5% CO₂ למשך הניסוי. שנה את כל המדיה בכל באר מדי יום.
   הערה: מניסיוננו, תרביות איברים נשירים נגועים בל. מונוציטוגנים נשארות בנות קיימא במשך 48 שעות ותרביות איברים נשירים למשך 72 שעות.

טבלה 1: מתכוני מדיה. רכיבים וריכוזים להכנת חיץ שטיפה, מדיום איסוף, מדיום וילוס ומדיום נשיר

חיץ כביסה	אמצעי גבייה	מדיום וילוס	מדיום עשרוני
PBS	DMEM/F-12 עם GlutaMAX	DMEM/F-12 עם GlutaMAX	DMEM/F-12 עם GlutaMAX
פניצילין 100 יחב"ל/מ"ל	סרום בקר עוברי 2.5%	סרום בקר עוברי 20%	סרום בקר עוברי 2.5%
סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל	פניצילין 100 יחב"ל/מ"ל	פניצילין 100 יחב"ל/מ"ל	17β-אסטרדיול 300 עמ'/מ"ל
גנטמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל	סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל	סטרפטומיצין 100 מיקרוגרם/מ"ל	פרוגסטרון 20 נ"ג/מ"ל
אמפוטריצין B 1.25 מיקרוגרם/מ"ל	גנטמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל
	אמפוטריצין B 1.25 מיקרוגרם/מ"ל

תוצאות

איור 1: תרביות איברים וילוס – תמונות גסות ומיקרוסקופיות מייצגות.

(A) שני עצים סופניים בגיל הריון של 6 שבועות, כפי שנצפו במיקרוסקופ מנתח. שימו לב לקצוות ה"רכים" (ראשי החץ) ולכלי הדם העובריים הבולטים העוברים בין ענפי העץ משמאל שהופכים את היצירה הזו למתאימה לתרבית איברים. (B) מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי של תרבית איברים (גיל ה...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שקיות עיקור	פישר סיינטיפיק	01-812-54	עבור autoclaving כלי ניתוח בודדים
מסננת רשת עדינה	Cuisinart (Amazon.com)	נה	יש לעטוף לחלוטין ברדיד אלומיניום ובאוטוקלאבה לפני איסוף הממחמות.
קארבוי עם ספיגוט	פישר סיינטיפיק	03-007-647	להכנת נפח גדול של חיץ שטיפה.
חבילות קרח	מעבדות נורטק	GB8818	אין צורך לרכוש אותם, אלא ניתן למחזר/לעשות בהם שימוש חוזר מכל משלוח מעבדה שגרתי הכולל אותם באריזה.
70% אתנול	VWR	V1001	פתרון 70% מיוצר על ידי הוספת dH20 ל 190 או 200 הוכחת מחקר כיתה אלכוהול.
10% אקונומיקה	אספקה סניטרית שעווה	CLO 30966	פתרון 10% נעשה על ידי הוספת dH20.
תיבת תאורה	לייטבוקס לומינה (dickblick.com)	55305-2009	שימו לב לנורות חלופיות שנרכשו גם בבליק (55305.0100)
מיקרו מלקחיים מנתחים	סטולטינג	52102-43	4 אינץ', 1x2 0.5 מ"מ, עקומה קלה
מיקרו מלקחיים מנתחים	סטולטינג	52102-06	4in, ישר בסדר, חד
מיקרו חיתוך vannas מספריים קפיץ	סטולטינג	52130-01P	מספריים קפיציים McPherson-Vannas, 8.5 ס"מ, 0.33 טיפ, עיקול קל
מיקרוסקופ מנתח	לייקה מיקרוסיסטמס	MZ16 או M60	הייתה לנו הצלחה עם הדגמים המפורטים. מקורות אור גמישים חיצוניים לצוואר אווז מועילים אך אינם הכרחיים.
50 מ"ל צינורות חרוטיים	סיגמא-אולדריץ' (קורנינג)	CLS4558
פוספט חוצץ מלוחים	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	אנו רוכשים ממתקן הליבה של תרבית רקמות באוניברסיטה שלנו, אפשרויות חלופיות כגון זה זמינות.
10X פוספט מלח חוצץ	טקנובה	P0195	להכנת חיץ Wash אנו משתמשים ב- 10X PBS
תערובת חומרים מזינים DMEM/F-12 (בשר חזיר) עם GlutaMAX	Gibco (טכנולוגיות חיים)	10565-018	אנו רוכשים נוסחת מדיה ספציפית זו, המכילה 2.438 גרם / ליטר סודיום ביקרבונט, 55 מ"ג / ליטר נתרן פירובט, ו 4.5 גרם / ליטר גלוקוז
גנטמיצין	תרמופישר סיינטיפיק	15710072	מלאי פי 1000. ממליץ להכין ולאחסן aliquots ב -20 ° C כדי למנוע הקפאה/הפשרה.
פניצילין/סטרפטומיצין	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	מלאי פי 100. ממליץ להכין ולאחסן aliquots ב -20 ° C כדי למנוע הקפאה/הפשרה.
אמפוטריצין ב	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15290-018	מלאי פי 500. ממליץ להכין ולאחסן aliquots ב -20 ° C כדי למנוע הקפאה/הפשרה.
פרוגסטרון	סיגמא-אולדריץ'	P8783	תמיסת מלאי של 1 מ"מ מיוצרת על ידי בנייה מחדש של אבקת פרוגסטרון 15.7 מ"ג באתנול 15.7 מ"ל והוספת PBS של 34.3 מ"ל. התמיסה מסוננת סטרילית, מעוטרת ומאוחסנת בטמפרטורה של -20°C.
17β-אסטרדיול	סיגמא-אולדריץ'	E2758	תמיסת מלאי של 10 מיקרומטר מיוצרת על ידי בנייה מחדש של אבקת אסטרדיול 13.5 מ"ג באתנול 10 מ"ל והוספת PBS של 40 מ"ל. התמיסה מסוננת סטרילית, מעוטרת ומאוחסנת בטמפרטורה של -20°C.
מסנן אבק עליון (0.22 מיקרומטר)	סיגמא-אולדריץ' (קורנינג)	CLS430769	לסינון סטרילי של אמצעי האיסוף לאחר ההכנה
צלחת תרבית רקמה 6 בארות	BD בז	353224	פוליסטירן, טיפול בתרבית רקמות
6-באר transwells	מיליפור	PICM03050	אינסרט - קוטר 30 מ"מ, גודל נקבוביות 0.4μm קרום PTFE הידרופילי בגודל נקבוביות
מטריצה חוץ-תאית (לדוגמה, מטריצת מטריג'ל)	BD Biosciences	354234	השתמשנו במטריקס מטריג'ל במחקרים שלנו. זהו מוצק בטמפרטורת החדר ובטמפרטורה של -20°C. יש להימנע מהקפאה/הפשרה חוזרת. הפשיר בקבוק לתמיסה צמיגה ב 4 ° C, והכן ~ 300μL aliquotsin בחדר הקר עם קצות פיפטה צוננים. יש לאחסן aliquots ב -20 °C.
Paraformaldehyde, 16% w/v תמיסה מימית	אלפא עזר	30525-89-4	עבור קיבוע רקמות, הכנה חדשה של 4% paraformaldehyde נעשה על ידי דילול מלאי זה PBS.
אינקובטור תרביות רקמה, מתוחזק ב 37 ° C, 5% CO2, 3% חמצן (אופציונלי עבור תרביות איברים villous)			עבור ניסויים מסוימים, היפוקסיה עשויה להיות מועדפת. ניתן לקבוע זאת במספר דרכים, כולל הוספת חנקן אקסוגני באמצעות בלון גז, צינורות טייגון ווסת.
צנטריפוגה עליונה של ספסל