יצירת מודל תרבית תאים חוץ גופית של זיהום משותף במלריה-HIV

תקציר

מקור: Finney, C. et al., מודל In Vitro למדידת תגובות חיסוניות למלריה בהקשר של זיהום משותף ב- HIV.J. Vis. Exp.(2015)

סרטון זה מדגים את הדור של מודל תרבית תאים בהדבקה משותפת של מלריה-HIV במבחנה. תאי דם חד-גרעיניים היקפיים נגועים ב- HIV בתרבית משותפת עם אריתרוציטים טפיליים של פלסמודיום פלציפרום עשויים לתמוך זה בצמיחתו של זה ולספק תובנות לגבי התגובות החיסוניות והתקדמות המחלה בזיהומים משותפים של HIV ומלריה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

זהירות: עבודה עם דגימות דם אנושיות וטפילי מלריה אנושיים דורשת אמצעי זהירות. תמיד ללבוש מעיל מעבדה, כפפות, ולעבוד בארון בטיחות ביולוגית רמה 2. במקרה של חשיפה מלעורית בשוגג למלריה אנושית, יש לדווח לבריאות ובטיחות לטיפול מניעתי. כמו כן, יש לנקוט שיקולי בטיחות נוספים לעבודה עם נגיף הכשל החיסוני האנושי HIV(+) דם. לבשו מעיל מעבדה עם סגירה אחורית. כפפה כפולה (הכפפה העליונה צריכה להיות לטקס). בצע את כל הטיפול בארון בטיחות ביולוגית ברמה 2. אין להשתמש בזכוכית או בחפצים חדים. אין להשתמש בשואף. יש להניח את כל הפריטים המזוהמים בתמיסת virox או אקונומיקה למשך שעה לפחות לפני השלכה. יש לשטוף את כל המשטחים עם virox ואולטרה סגול (UV) למשך שעה אחת לאחר השימוש. שים לב שלכל מוסד יהיו תקנות בטיחות ביולוגית ספציפיות משלו שיש לעקוב אחריהן. דווח על כל החשיפות המקריות לדם נגוע ב- HIV לבריאות ובטיחות לצורך הערכה ושיקול של מניעה אפשרית לאחר החשיפה.

הערה: קיימים זנים שונים של טפילי המלריה P. falciparum. ITG שימש לניסויים אלה, אך ניתן להשתמש בזנים שונים. הוראות מצוינות על הקפאה והפשרה של טפילי פלסמודיום פלציפרום זמינות באתר MR4.

1. הכנת RPMI-A לתרבית טפילי מלריה

1. הכינו RPMI-0 על ידי ערבוב של 950 מ"ל מים מזוקקים פעמיים (ddH₂O), שקיק אחד של אבקת Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 גרם של N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES), 2 גרם של סודיום ביקרבונט, ו-1.35 מ"ג של היפוקסנטין.
2. הפשירו סרום אנושי מומת חום משני תורמים שונים. תורמי AB הם הטובים ביותר, אך ניתן להשתמש בכל אחד מהם אם גדלים טפילים בכדוריות דם אדומות מסוג O (RBC). הפוך צינורות כדי לערבב. אם הסרום מכיל חומר חלקיקי או סמיך, יש להסתובב במהירות של 2,000 סל"ד ולאחר מכן לסנן את החלק הנוזלי באמצעות יחידת סינון של 0.45 מיקרומטר.
3. באמצעות מסנן יחידת סינון 0.2 מיקרומטר 180 מ"ל של RPMI-0, 20 מ"ל של סרום אנושי (10 מ"ל מכל תורם), ו 0.5 מ"ל של 10 מ"ג / מ"ל gentamycin.
   הערה: סרום אנושי עלול לסתום את המסנן, כך שייתכן שתידרש יותר מיחידת סינון אחת.
4. יש לסמן את הבקבוק הבינוני עם RPMI-A, את התאריך ואת מקור הסרום. מכניסים למקרר עד לצורך. RPMI-A עשוי להפוך מעונן בעת קירור. זה נורמלי, אבל עננות גוברת היא סימן של זיהום.
   הערה: צמיחת הטפילים עשויה להשתנות בנסיובים שונים של תורמים. מומלץ לבדוק את כל אצוות הסרום האנושי לצמיחת טפילים טובה לפני השימוש.

2. הכנת תאי דם אדומים אנושיים לתרבית טפילים

הערה: תורמי דם צריכים להיות מסוג O.

1. לאסוף 7-10 מ"ל של דם לתוך צינורות חומצה ציטראט-דקסטרוז (ACD). כתוב את תעודת הזהות של התורם ואת תאריך האיסוף על התווית.
2. יש לאחסן דם בטמפרטורה של 4 ^מעלותצלזיוס עד לצורך. השתמש בדם עבור תרביות טפילים בתוך חודש אחד.
3. נגבו את החלק העליון של הצינור עם 70% אתנול. הסר בזהירות את הפקק והשלך אותו. מעבירים דם לצינור של 15 מ"ל. סחרור במשך 3 דקות במהירות של 1,000 x גרם. הסר פלזמה על ידי שאיפה.
4. להשעות RBC עם נפח שווה של RPMI-0 חם. סבבו במשך 5 דקות במהירות של 1,000 x גרם. להסיר את מעיל באפי על ידי שאיפה, resuspend ב 5 מ"ל של RPMI-0, ולחזור על הכביסה 2 פעמים נוספות.
5. מוציאים את הסופרנאטנט ומוסיפים מספיק סל"ד-A כדי לייצר תערובת שהיא 50% RBC בנפח.
6. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 ^מעלותצלזיוס עד לצורך.

3. שמירה על תרביות טפילים

1. טרום חם RPMI-A ל 37 ^oC.
2. הכניסו טפילים מופשרים (ראו פרוטוקול MR4 להליך הפשרה) לתוך בקבוק T25 עם 5 מ"ל RPMI-A ו-75 מיקרוליטר RBC אנושי שטוף לקבלת המטוקריט של ~3%. הערה: המטוקריט מודד את נפח RBC בהשוואה לנפח הכולל. כדי לחשב המטוקריט, למדוד את נפח RBC ארוז לנפח הכולל של בינוני בתוספת RBC. נניח כי הטפילים מופשרים יתרמו 75 μl של RBC. על ידי הוספת 150 μl של מלאי RBC (שווה ערך להוספת 75 μl של RBC ארוז) לבקבוק יש סך של 150 μl של RBC לתוך 5 מ"ל של בינוני, אשר שווה המטוקריט של 3% (150 μl / 5,000 μl x 100% = 3%).
3. גז את הבקבוק במשך 30 שניות עם תערובת גז טפילים (1% O₂, 3% CO₂, איזון N₂). אוטמים ומניחים את הבקבוק רחב כלפי מטה באינקובטור של 37 ^מעלותצלזיוס כדי לאפשר את שטח הפנים הגדול ביותר להחלפת גזים.
4. כדי לשנות את המדיום ולבדוק פרזיטמיה (צריך להיעשות מדי יום), בזהירות להזיז את הבקבוק כדי לא להפריע שכבת RBC. בעזרת פיפטת פסטר סטרילית מנותקת שואבת את מדיום התרבית מבלי להפריע לשכבת הדם.
5. כדי לבדוק פרזיטמיה, הסר דגימה של 10 μl משכבת הדם, הנח אותה על מגלשת זכוכית, ובאמצעות מגלשת זכוכית שנייה צור סרט דם דק. הניחו למגלשה להתייבש.
6. מניחים 4 מ"ל של RPMI-A טרי לתוך הצלוחית, מערבבים בעדינות, גז במשך 30 שניות, ומניחים באינקובטור ב 37 ° C.
7. הכתימו את המגלשה באמצעות ערכת צביעה Hema3 בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   1. להכתמה מיטבית, יש לטבול את המגלשות בתמיסת הקיבוע למשך 10 שניות, בתמיסה I למשך 10 שניות ובתמיסה II למשך 30 שניות. יש לשטוף במים ולהשאיר את המגלשות לייבוש.
8. חישוב פרזיטמיה על ידי ספירת מספר פלסמודיום falciparum RBC, PfRBC (סגול כהה מוכתם) לעומת המספר הכולל של RBC (ורוד מוכתם). ספור בסך הכל 300 תאים כדי להבטיח דיוק.
9. כאשר טפילים הגיעו לטפילים של 5%, להרחיב את התרבית לתוך צלוחיות T75, באמצעות 40 מ"ל של RPMI-A, ו 500 μl של RBC.

4. סנכרון טפילים

הערה: יום לפני הניסוי, סנכרנו את תרבית הטפילים על ידי טיפול בה עם אלנין. רק טפילים בשלב הטבעתי ו-RBCs לא נגועים ישרדו את הטיפול הזה. סנכרון אלנין ייתן לכם למחרת תרבית טרופוזואיט טהורה שניתן להשתמש בה בניסויי התרבות המשותפת. הקפידו להתחיל עם תרבית טפילים המכילה את רוב הטפילים בשלב הטבעת.

1. הכינו תמיסת אלנין על ידי ערבוב 8.01 גרם אלנין (300 מילימול) ו-0.365 גרם טריס (10 מ"מ) ל-300 מ"ל של ddH₂O. הביאו את רמת החומציות ל-7.4. יש לעקר את המסנן באמצעות יחידת מסנן בגודל 0.2 מיקרומטר.
2. מחממים מראש את תמיסת האלנין ל 37 ^מעלותצלזיוס.
3. סובבו את תרבית הטפילים (5 דקות x 1,000 x גרם), והסירו את המדיום.
4. גלולת השהיה מחדש ב-19 נפחים של תמיסת אלנין (1 מ"ל RBC ארוז עד 19 מ"ל תמיסת אלנין). יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
5. ספין 5 דקות x 1,000 x גרם. שאפו סופרנטנט. יש לשטוף בסל"ד-0 פעם אחת. לשאוף supernatant ו resuspend ב RPMI-A ולהתאים hematocrit ל ~ 3%. בקבוק גז ולהחזיר ל 37 ^oC.
   הערה: עבור ניסויים בתרבית משותפת, יש צורך בטפילים מינימליים של 5% טרופוזואיטים, כאשר 10% פרזיטמיה נחשבת אופטימלית.

5. הכנת טפילים ו-RBC לניסויים בתרבות משותפת

1. השתמש ביחס של 3 PfRBC לכל PBMC בניסויים בתרבית משותפת כדי לגרום לתגובה דלקתית. כדי לחשב את סך PfRBC, לכמת פרזיטמיה על ידי ביצוע כתם דם דק כמתואר ב 3.5, והמטוקריט על ידי ספירת מספר RBCs לכל מ"ל של תרבית טפיל באמצעות המוציטומטר.
   מספר PfRBC = % פרזיטמיה x סך RBC / ml x ml של תרבית. לדוגמה, 10 מ"ל של תרבית ב 10 x 10⁶ RBC / ml ו 10% parasitemia שווה ל 0.1 x 10⁶/ml x 10 ml = 10 x 10⁶ PfRBC.
2. סובבו את תרבית הטפילים במשך 5 דקות במהירות של 1,000 x גרם (RT). יש לשאוף בינוני ולהשהות מחדש ב-6 x 10⁶ PfRBC למ"ל ב-RPMI-S+ (500 מ"ל RPMI-1640 בתוספת L-גלוטמין ו-HEPES, 10% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS), 1.5 מ"ל גנטמיצין, 5 מ"ל נתרן פירובט 100 mM, 5 מ"ל 10 mM MEM חומצות אמינו לא חיוניות, 5 מ"ל 5mM β-מרקפטואתנול).
3. קח דם בקרה (RBC לא נגוע מאותו תורם המשמש לשמירה על תרבית הטפיל), חשב המטוקריט, והשהה מחדש ב- RPMI-S+ באותו מספר RBC למ"ל כמו תרבית הטפיל.

6. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMC)

1. יש לאסוף דם ורידי בצינורות נתרן הפרין (ירוק עליון) הן מתורם HIV(+) כרוני והן מבקרת HIV(-). אין להשתמש בחומצה אתילאנדיאמין טטראצטית (EDTA) כנוגד קרישה, שכן פעולת תצבית הסידן של EDTA משפיעה על תפקוד התאים. בממוצע לצפות בין 5-10 x 10⁶ PBMC לכל 10 מ"ל של דם. עבור ניסוי טיפוסי לאסוף 30 מ"ל של דם מכל תורם. יהיה צורך להתאים את נפח הדם בהתאם לדרישות הניסוי.
2. מהר ככל האפשר ובהחלט תוך שעה מרגע איסוף הדם, הוציאו את הדם מהצינורות והכניסו אותו לצינורית פלסטיק של 50 מ"ל. מונוציטים בפרט יופעלו ויידבקו לזכוכית, ולכן חשוב שאם משתמשים בצינורות איסוף דם מזכוכית תאים יוסרו מהר ככל האפשר.
3. סובבו את הדם במהירות של 1,000 x גרם במשך 15 דקות ואספו פלזמה (ניתן להשתמש בה למחקרים אחרים במידת הצורך – אם לא ניתן לדלג על שלב זה). לדלל את הדם בנפח שווה של מלח חוצץ פוספט קר של Dulbecco (DPBS).
4. מניחים 15 מ"ל של RT Ficoll לתוך צינור 50 מ"ל. לאט לאט, בעזרת פיפטת העברה סטרילית מפלסטיק, מניחים את תמיסת הדם/DPBS על הפיקול ללא כל ערבוב. מקסימום של 25 מ"ל של תמיסת דם / DPBS יכול להיות שכבות על כל 15 מ"ל של Ficoll.
5. סובב את מעברי הצבע במשך 30 דקות ב- RT במהירות של 600 x גרם. ודא שההגדרה 'ללא בלמים' מופעלת.
6. לאחר שהתאים הסתובבו, חפש את הממשק בין שני השלבים. כאן נמצאים המרכזיות. באמצעות פיפטת העברה סטרילית מפלסטיק אספו את ה-PBMC מהממשק (ראו איור 1). מזעור זיהום על ידי RBC.
7. מניחים תאים שנאספו בצינורות של 50 מ"ל, עם לא יותר מ -20 מ"ל לכל צינור. צינור עליון עד 50 מ"ל עם DPBS קר סטרילי.
8. סובב את התאים במשך 10 דקות ב 4 ^oC ב 300 x גרם.
9. יש להשליך את הסופרנטנט, להשהות מחדש את הגלולה ב-DPBS קר סטרילי במינון 5 מ"ל, ולאגד את כל התאים מאותו תורם לצינור אחד. קשטו עד 50 מ"ל ב-DPBS סטרילי, וחזרו על שלבי השטיפה פעמיים נוספות.
10. השהה תאים בתווך 10 מ"ל RPMI-S+.
11. מוציאים אליציטוט של 20 μl ומערבבים עם 20 μl של טריפאן כחול. פיפטה 10 μl בהמוציטומטר וסופרים את התאים החיים (תאים שלא קלטו את הצבע הכחול – כל התאים הכחולים מתים). השתמש בהמוציטומטר כדי לחשב את מספר התא בתמיסה באופן הבא.
    הערה: להמוציטומטר יש רשת של ממדים מוגדרים, כך שהשטח המכוסה על ידי הקווים ידוע.
    1. ודא שההמוציטומטר נקי. הניחו את הכיסוי על אזור הספירה. טען 10 μl של תמיסת התא על ידי הצבת קצה פיפטה לתוך אחת הבארות בצורת V. האזור שמתחת לתלוש הכיסוי ימולא על ידי פעולה נימית.
    2. מניחים את ההמוציטומטר הטעון מתחת למיקרוסקופ. הרשת המלאה של ההמוציטומטר מכילה 9 ריבועים של 1 מ"מ² כל אחד. ספור את כל התאים בתוך כל ריבוע גדול. אם קיימים יותר מדי תאים, דללו את התמיסה עוד יותר וספרו מחדש.
    3. חשב את ריכוז התאים באופן הבא: סה"כ תאים/מ"ל = (סה"כ תאים שנספרו / # של ריבועים) x גורם דילול x 10,000 תאים/מ"ל, למשל, (500 תאים / 5 ריבועים) x גורם דילול של 20 x 10,000 תאים/מ"ל = 20 x 10⁶ תאים בסך הכל.
12. כוונן את המדיום לריכוז סופי של 10 x 10⁶ למ"ל (מדיום RPMI-S+).

7. מלריה/HIV תרבות זיהום משותף

1. צלחת 100 μl של PBMCs מבודדים ו 400 μl של RPMI-S+ בינוני עד צלחת 24 באר (1 x 10⁶ PBMC לכל באר). ודא כי הבארות מוקמות במשולש: 3 בארות עבור RBC לא נגוע, 3 בארות עם PfRBC, 3 בארות עם בינוני, ו 3 בארות עם PMA/Ionomycin. זה גם עבור דגימות HIV (+) ו- HIV (-).
2. עבור בארות PfRBC, מניחים 3 x 10⁶ PfRBC בכל אחת מהבארות (500 מיקרוליטר של תרבית טפילים שהוכנה ב 5.2).
3. עבור בארות RBC לא נגועות, מקם 500 μl של תרבית RBC לא נגועה שהוכנה ב 5.3 בכל אחת מהבארות.
4. עבור בארות בינוניות, מקם 500 μl של מדיום RPMI-S+ בכל אחת מהבארות.
5. עבור בארות PMA/Ionomycin, הכינו תמיסת PMA/Ionomycin (2.5 pg/ml, 250 pg/ml בהתאמה). מקם 500 μl של תמיסה זו בכל באר.
   הערה: כממריצים רבי עוצמה של הפרשת ציטוקינים בתאי T, PMA ויונומיצין משמשים כבקרות חיוביות כדי להבטיח תפקוד של תאים.
6. מניחים את הצלחת על 37 ^oC באינקובטור 5% CO₂.
7. אופציונלי: השתמש בתאים עודפים לניתוח פנוטיפי באמצעות ציטומטריית זרימה או אחסן אותם בתמיסת ייצוב RNA לניתוח ביטוי mRNA עתידי.

8. איתור תגובות חיסוניות למלריה

הערה: בצע ניסויים בתרבית משותפת במשך 4 ימים. לא נדרש שינוי בינוני במהלך תקופה זו. נקודת הזמן האופטימלית תהיה תלויה בסוג התא של עניין ואת השאלה שנשאלה. דגירה של 12-48 שעות היא אופטימלית עבור תגובות מונוציטיות ל- PfRBCs, בעוד שתגובות לימפוציטים נצפו בצורה הטובה ביותר לאחר 72-96 שעות. יהיה צורך למטב את נקודות הזמן בהתבסס על שאלת הניסוי. ניתן להשתמש בפרקי זמן קצרים יותר (2-4 שעות) אם האינטראקציה בין PfRBC תקין ו- PBMCs מעניינת.

1. יש לסובב את הצלחת במהירות של 300 x גרם למשך 3 דקות לתאי כדור. אספו 700 מיקרוליטר של תרבית מכל באר.
2. סובב supernatant ב 1,000 x גרם במשך 5 דקות כדי לנקות את כל הפסולת.
3. Aliquot פינה supernatant לפי הצורך, לתייג, ולהקפיא ב מתחת -20 ° C עד ניתוח של גורמים מופרשים יש לבצע.

תוצאות

איור 1. תיאור של ספין פוסט שיפוע פיקול המדגים את מיקומם של PBMCs.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אלנין	סיגמא	A7377
BD Vacutainer ACD פתרון A	ב.ד.	364506
BD Vacutainer נתרן הפרין	ב.ד.	17-1440-02
DPBS (ללא סידן, ללא מגנזיום)	קורנינג	21-031-CV
סרום בקר עוברי	סיגמא	F1051	יש להשבית את החימום לפני השימוש
Ficoll-Paque PLUS	GE שירותי בריאות	17-1440-02
גנטמיצין (10 מ"ג/מ"ל)	גיבקו	15710-064
סט צביעה Hema3	פישר	122-911
HEPES	פישר	BP310-500
היפוקסנטין	סיגמא	H9636
יונומיצין	סיגמא	I3909
MEM חומצות אמינו לא חיוניות (10mM)	גיבקו	11140
PMA	סיגמא	P8139
אבקת RPMI-1640	טכנולוגיות חיים	31800-022
RPMI-1640 עם L-גלוטמין ו-HEPES	תרמו סיינטיפיק	SH30255.01
סודיום ביקרבונט (אבקה, תרבית תאים)	סיגמא	S5761
נתרן פירובט (100mM)	גיבקו	11360
Tris (בסיס Trizma)	סיגמא	T6066
טריזול	אמביון	15596018
טריפאן בלו (0.4%)	גיבקו	15250-061
תערובת גז טפילים	בהזמנה מיוחדת		3% CO2, 1% O2, איזון N2