השראת מחלת השתל לעומת המאכסן במודלים של עכברים באמצעות השתלת מח עצם אלוגנית והשתלת תאים טחול

תקציר

מקור: Buchele, V., et al. אינדוקציה של מחלת השתלת מעיים נגד המאכסן וההערכה המיני-אנדוסקופית שלה בעכברים חיים. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים את השראת מחלת השתל נגד המאכסן של המעי, GvHD, בעכבר מושתל המוקרן באופן קטלני באמצעות תאי גזע המטופויטיים אלוגניים ולימפוציטים מסוג T אלוריאקטיביים מעוררי GvHD. פרוטוקול זה מסייע לבסס מודל GvHD חמור במעי כדי להבין את מנגנון המחלה ולפתח אפשרויות טיפוליות חדשניות.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. אינדוקציה GvHD

1. יום 0: הקרנת גוף כוללת של העכברים המקבלים
   1. השתמש בעכברי CD45.2+ H2kd+ BALB/c בנות 10 שבועות לפחות כמושתלים.
   2. לשקול ולתעד את משקל העכברים המקבלים לפני השראת GvHD.
      הערה: ודא כי המקבל יש משקל גוף מינימלי של 20 גרם. משקל הגוף ההתחלתי ישמש כערך הייחוס לחישוב הירידה במשקל של העכבר הבודד במהלך השראת GvHD והתקדמותו.
   3. מניחים עד חמישה עכברים במיכל של מקרין רנטגן.
   4. להקרין את העכברים על ידי הקרנת גוף כוללת עם מנה אחת של 8 Gy של רנטגן. השתמש ב- Cs137 כמקור קרינה.
2. יום 1: הרכבה מחדש של עכברים מוקרנים עם מח עצם מדולדל תאי T
   הערה: השתלת תאי מח עצם אלוגניים, כמפורט בסעיף 1.2, צריכה להתבצע תוך 24 שעות לאחר ההקרנה. בצע את ההליכים המתוארים להלן בתרבית רקמה סטרילית והשתמש בריאגנטים מסוננים. השתמש CD45.1/Ly5.1 B6 allogeneic. עכברי SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl כתורמים למח עצם מדולדל תאי T.
   1. המתת חסד CD45.1/Ly5.1 B6. עכברי SJL שיתרמו תאי מח עצם אלוגניים בהתאם להנחיות המוסדיות, 12-24 שעות לאחר הקרנת עכברי BALB/c המושלת. לשם כך, להרדים את CD45.1 / Ly5.1 B6. עכברי SJL על ידי שאיפה של 5% איזופלורן. יש להמשיך עם החשיפה לאיזופלורן מעל דקה לאחר דום נשימה ולאשר המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם.
   2. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם אתנול 70%.
   3. מקם את העכבר על נדן עבודה נקי כך שהעכבר יהיה במצב נוטה, כאשר אחוריו פונים לנסיין. הרימו את הפרווה בעקב אכילס בעזרת קצה מלקחיים Semken באורך 13 ס"מ וקצוות מעוקלים משוננים. חותכים את העור בין המלקחיים לעקב במספריים עדינים קשוחים בקוטר 8.5 ס"מ עם קצוות ישרים.
   4. הארכת החתך באופן גולגולתי (כלומר, מהעקב מעל הרגל התחתונה והירך לאזור הירך). הסר את העור והפרווה מהגפה האחורית בעזרת המלקחיים.
   5. בצע את אותו הליך על הגפה האחורית השנייה.
   6. הסר את הגפיים האחוריות על ידי חיתוך דרך מפרקי הירך הסמוכים.
   7. חותכים את הכפות האחוריות. חתך דרך מפרק הברך. אחסנו את הירך והשוק של כל איבר אחורי יחד בצלחת פטרי בקוטר 92 מ"מ מלאה בתמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) על קרח.
   8. נקו היטב את עצמות עצם הירך והטיביה על ידי הסרת רקמת שריר רבה ככל האפשר מכל ירך ושוק. מעבירים את עצמות עצם הירך והטיביה לצינור בנפח 50 מ"ל מלא בסל"ד סטרילי 1640 בינוני ומניחים אותו על קרח רטוב עד שכל עצמות השוקה ועצם הירך שנאספו בשלב 1.2.7 מנוקות מרקמת השריר.
   9. כדי לבודד את מח העצם, העבר עצם ירך אחת או עצם השוקה בכל פעם (אשר נוקתה כמתואר בשלב 1.2.8) מצינור 50 מ"ל לצלחת פטרי (בקוטר של 92 מ"מ) מלאה בתווך RPMI 1640. חתכו את קצות עצם הירך או השוקה בעזרת אזמל כדי לקבל גישה לחלל העצם המכיל את מח העצם.
   10. הכן צינור איסוף 50 מ"ל עם 5 מ"ל של מדיום RPMI 1640. הכנס מחט 26 גרם המחוברת למזרק 1 מ"ל מלא 1 מ"ל של מדיום RPMI 1640 לתוך חלל העצם ושטוף את מח העצם מהחלל לתוך צינור האיסוף על ידי דחיפת הבוכנה.
   11. חזור על שלב 1.2.10 עד שהעצם נראית בהירה ומבריקה (כלומר, חלל העצם נראה לעין ללא מח עצם אדמדם). השליכו את העצם הריקה.
   12. חזור על שלבים 1.2.9 - 1.2.11, באמצעות כל עצמות עצם הירך והטיביה משלב 1.2.8, ואסוף את כל חתיכות מח העצם שנמצאו באותו צינור איסוף של 50 מ"ל משלב 1.2.10. שמור את צינור האיסוף על קרח רטוב עד שכל העצמות משלב 1.2.8 יעובדו בהתאם.
   13. צרו תרחיף חד-תאי על-ידי הדבקה עדינה של חתיכות מח העצם הסמוקות והמתפוררות מעלה ומטה. סנן את המתלה החד-תאי של מח העצם דרך מסננת תאי רשת של 40 מיקרומטר המונחת על צינור איסוף חדש של 50 מ"ל.
   14. צנטריפוגה צינור איסוף 50 מ"ל המכיל את מח העצם תא בודד מתלה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
   15. יש להשהות מחדש את הגלולה ב-5 מ"ל של חיץ ACK (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7.2) לליזה של תאי דם אדומים. דוגרים על תרחיף התא למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסף מיד 10 מ"ל של תמיסת PBS לתרחיף התא.
   16. צנטריפוגה את המתלה ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את התאים ב 2 מ"ל של תמיסת PBS.
   17. לספור את תאי מח העצם, באמצעות hemocytometer. שמור aliquot של 6 x 10⁶ תאים עבור ניתוח ציטומטריה זרימה כדי לבדוק את טוהר התאים לאחר טיהור התא (ראה שלב 1.2.20).
   18. לדלדול תאי T מתרחיף תא בודד של מח עצם, השתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית. דלדול מגנטי של תאי CD90.2+ (כלומר, לימפוציטים) מסך תאי מח העצם, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   19. ספור את תאי מח העצם המרוקנים של תאי T שבודדו כמתואר בשלב 1.2.18, באמצעות המוציטומטר. שמור aliquot של 1 x 106 תאים עבור ניתוח ציטומטריה זרימה שיבוצע מאוחר יותר, כמתואר בשלב 1.2.20.
       הערה: תפוקת התאים הממוצעת המופקת מעכבר תורם אחד היא בדרך כלל בין 2 x 107 ל 3.4 x 107 תאי מח עצם מדולדלים בתאי T.
   20. אשר דלדול מוצלח של תאי T על ידי ציטומטריית זרימה. כתם 1 x 10⁶ תאים, נשמר משלבים 1.2.17 (תאי מח עצם לפני הפרדת תאים מגנטיים) ו- 1.2.19 (תאי מח עצם מדולדלים בתאי T לאחר הפרדת תאים מגנטיים), עם הנוגדנים הבאים: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ו- α-CD8α (53-6.7). השתמש בתאים הנותרים משלב 1.2.17 כפקד לא מוכתם ולפקדי צביעה יחידה, כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה.
       1. העבר 1 x 10⁶ תאים מכל דגימה לבאר של צלחת 96 באר עם תחתית V כדי לבצע את הליך הצביעה הציטומטרית של זרימה.
       2. סובב כלפי מטה את התאים בתוך צלחת 96 בארות (שלב 1.2.20.1) ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את התאים ב 100 μL של חיץ FACS (PBS בתוספת 3% סרום בקר מסונן).
       3. צנטריפוגה את התאים בתוך צלחת 96 באר ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
       4. הוסף כמות מתאימה של נוגדן הבחירה (השווה לשלב 1.2.20) לדגימות עבור צביעה בודדת במאגר FACS של 100 μL
       .
       5. הכינו תערובת של כל הנוגדנים (תערובת מאסטר) המכילה את הכמויות המתאימות המספיקות כדי להכתים בנפרד את תאי מח העצם שנשתמרו מלפני (ראה שלב 1.2.17) ולאחר (ראה שלב 1.2.19) דלדול תאי T מגנטיים. הוסף 100 μL של תערובת האב לשני aliquots.
       6. הוסף רק 100 μL של מאגר FACS לדגימה הלא מוכתמת.
       7. לדגור על התאים בתוך צלחת 96 באר במשך 20 דקות ב 4 ° C בחושך.
       8. הוסף 100 μL של חיץ FACS וצנטריפוגה את התאים בתוך צלחת 96 בארות ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את התאים ב 100 μL של מאגר FACS.
       9. צנטריפוגה את התאים ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את התאים ב 250 μL של מאגר FACS.
       10. מעבירים את הדגימות לצינור פוליסטירן עגול בנפח 5 מ"ל ומנתחים אותן באמצעות מכשיר ציטומטר זרימה המסוגל לזהות את המולקולות הפלואורסצנטיות ששימשו לסימון הנוגדנים ששימשו לאפיון דגימות התאים (ראה שלב 1.2.20).
       11. השווה את הרכב התא לפני ואחרי הפרדת התאים המגנטית.
           הערה: טוהר של כ-95% תאי CD45.1+CD3 (כלומר, מח עצם מדולדל בתאי T) בתוך השער החי מושג בדרך כלל.
   21. שטפו את מתלי תאי מח העצם המרוקנים מתאי T 2x בתמיסת PBS (450 x גרם למשך 5 דקות ב-4°C) ולבסוף, השהו מחדש את התאים בתמיסת PBS, תוך התאמת ריכוז התא ל-5 x 10⁷ תאים/מ"ל. שמור את התאים על קרח רטוב עד ההזרקה.
   22. הזריקו תאי מח עצם מדולדלים בתאי T לעכברים המושתלים, שהוקרנו יום קודם לכן (ראה סעיף 1.1).
       1. הניחו את עכבר הניסוי בתא חסין דליפה וגרמו להרדמה על ידי שאיפה של עד 4% איזופלורן, עד שהעכבר מאבד את הכרתו. אשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על ידי בדיקת אובדן רפלקס התיקון ואובדן רפלקס הנסיגה של הדוושה.
       2. הזריקו 5 x 10⁶ תאי מח עצם מרוקנים מתאי T (כלומר, 100 μL של 5x10⁷ תאים/מ"ל) המכילים תמיסת PBS באמצעות מזרק 1mL המצויד במחט 30 G תוך ורידי לתוך חלל retrobulbar המכיל את הסינוס הוורידי.
3. יום 2: העברת תאי T
   הערה: בצע את ההליכים המתוארים להלן בתרבית רקמה סטרילית והשתמש בריאגנטים מסוננים. השתמש CD45.2 C57Bl/6 (סוג פראי; WT) עכברים כתורמים לתאי T אלוריאקטיביים. השימוש במערכות סמנים קונגניים מאפשר להבחין בין סוגי תאים המטופויטיים של המקבל (CD45.2+ H2kd+ Balb/c) לבין סוגי תאים המטופויטיים של התורם (תאי מח עצם: CD45.1+ H2kb+ B6. עכברי SJL; תאי T אלוגניים: CD45.2+ עכברי H2kb+ C57/Bl6).
   1. המתת חסד של עכברי C57Bl/6 בהתאם להנחיות ולרשויות המוסדיות החלות. לכן, מרדימים עכברים על ידי שאיפה עם ריכוז של 5% isoflurane. המשך את החשיפה לאיזופלורן עד דקה לאחר דום נשימה ואשר המתת חסד על ידי פריקת צוואר הרחם. לחטא את הפרווה והעור של העכבר ביסודיות עם אתנול 70%.
   2. הניחו מסננת עם רשת 40 מיקרומטר על צינור איסוף של 50 מ"ל. מוציאים את הטחול ומניחים אותו על המסננת.
   3. עם בוכנה מזרק, comminute הטחול במסננת. שטפו את בוכנה המסננת והמזרק עם PBS כדי לאסוף את כל הטחול.
   4. צנטריפוגה את התאים בתוך צינור איסוף 50 מ"ל ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant.
   5. להשעות מחדש את הטחול ב 3 מ"ל של ACK lysing buffer כדי lyse תאי דם אדומים. דוגרים על תרחיף התא למשך 3 דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה את התאים ב 450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. להשליך את supernatant ו resuspend את הטחול ב PBS.
   6. לספור את תאי הטחול, באמצעות hemocytometer. הסט aliquot של 6 x 10⁶ תאים לניתוח ציטומטריית זרימה, כדי להעריך את גודל הטיהור בשלב 1.3.9.
   7. לבידוד כולל של תאי T CD3+ מהטחול הכולל, השתמש בערכת טיהור תאים זמינה מסחרית. בודד את תאי T הטפלניים, בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   8. ספור את תאי T CD3+ Splenic שבודדו כמתואר בשלב 1.3.7, באמצעות המוציטומטר. שמור aliquot של 1 x 10⁶ תאי T לניתוח ציטומטריית זרימה.
      הערה: התשואה הממוצעת של תאי T ספלניים לכל עכבר תורם שבודד על ידי הפרדת תאים מגנטית נעה בין 1.3 x 10⁷ ל 2 x 10⁷ תאים.
   9. לאשר את ההצלחה של בידוד תאי T על ידי ציטומטריית זרימה. לקבלת תיאור מפורט של פרוטוקול הצביעה, הכנס ובצע את השלבים 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. כתם 1 x 10⁶ splenocytes של שלבים 1.3.6 (לפני הפרדת התא המגנטי) ו 1.3.8 (לאחר הפרדת תאים מגנטיים) עם הנוגדנים הבאים: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) ו- α-CD8α (53-6.7).
      2. השתמש בתאים הנותרים משלב 1.3.6 כבקרה לא מוכתמת ועבור צביעה יחידה עם הנוגדנים המתאימים, כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה.
      3. השווה את הרכב התא לפני ואחרי הפרדת תאים מגנטית.
         הערה: יש להשיג טוהר של ≥95% מתאי T CD45.2+CD3+ בתוך שער הלימפוציטים החיים.
   10. שטפו את תאי T 2x עם PBS (450 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C), ולבסוף, להשעות מחדש את התאים בתמיסת PBS, התאמת ריכוז התא ל 7 x 10⁶ תאים / מ"ל. שמור את התאים על קרח עד ההזרקה.
   11. הזריקו תאי T אלוריאקטיביים וטבוריים (ראה שלב 1.3.10) לעכברי BALB/c מוקרנים שקיבלו בעבר תאי מח עצם מרוקנים מתאי CD45.1+ T (ראה שלב 1.2.22).
       1. יש להשרות הרדמה על ידי הנחת עכבר הניסוי בתא חסין דליפה שבו הוא נחשף לאיזופלורן של עד 4% עד שהוא מאבד את הכרתו. אשר שיכוך כאבים ואובדן הכרה על ידי בדיקת אובדן רפלקס התיקון ואובדן רפלקס הנסיגה של הדוושה.
       2. הזריקו 0.7 x 10⁶ תאי T CD3+ alloreactive באמצעות מזרק 1 מ"ל המצויד במחט 30 G (כלומר, 100 μL של 7 x 10⁶ תאים / מ"ל) המכילה תמיסת PBS (ראה שלב 1.3.10), תוך ורידי לתוך החלל retrobulbar של העכברים, כדי לגרום GvHD. להגדיר עכברים אלה כקבוצת הניסוי.
       3. הזריקו קבוצה אחרת של עכברים עם 100 μL של PBS בלבד, תוך ורידי לתוך חלל הרטרובולבר, וציינו קבוצה זו כקבוצת הביקורת, שנקראה לאחר מכן "עכברים ללא תאי T מושתלים (noT)".

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
BIOBEAM 2000 מקרין גמא	גמא-שירות Meical GmbH
מלח חוצץ פוספט (PBS)	Sigma-Aldrich ושות' LLC.	D8662-6x500ML
מלקחיים Semken (אורך: 13 ס"מ; משוננים, קצוות מעוקלים)	כלים מדעיים משובחים	11009-13
מספריים עדינים מוקשחים (אורך: 8.5 ס"מ; קצוות ישרים; קצה חיתוך: 24 מ"מ)	כלים מדעיים משובחים	14090-09
RPMI-1640 בינוני	Sigma-Aldrich ושות' LLC.	R8758-500ML
מחט היפודרמית (26G)	ב. בראון Melsungen AG	4657683
1 מזרק מ"ל	ב. בראון Melsungen AG	9166017V
צינור 50 מ"ל	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
מסננת תאים עם רשת רשת בגודל 40 מיקרומטר	BD בז	352340
מזרק אינסולין עם פנים סטרילי (30G)	ב.ד.	324826
ערכת בידוד תאי Pan T II, עכבר	Miltenyi ביוטק GmbH	130-095-130	הפרדת תאי מגנט לבידוד תאי T ספלניים
CD90.2 MicroBeads, עכבר	Miltenyi ביוטק GmbH	130-049-101	הפרדת תאי מגנט לבידוד תאי מח עצם מדולדלים של תאי T
מלקחיים ביופסיה	קרל סטורץ SE & Co ק"ג	61071 ZJ	חלק מהמערך הניסיוני לקולונוסקופיה
Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום מלח dihydrate (Na2EDTA)	קרל רוט GmbH & Co.KG	8043.2	מרכיב של ACK lysing buffer
Alexa Fluor 700 נוגדן CD45.2 נגד עכבר (שיבוט: 104; הרבה: B252126; RRID: AB_493731)	ביואגדה	109822
נוגדן PE/Cy7 נגד עכבר CD45.1 (שיבוט: A20; הרבה: B217246; RRID: AB_1134168)	ביואגדה	110730
נוגדן CD8a נגד עכבר APC/Cy7 (שיבוט: 53-6.7, הרבה: B247008; RRID: AB_312753)	ביואגדה	100714
פוראן / איזופלורן	AbbVie בע"מ	B506
סרום בקר מסונן	פאן ביוטק	עמ' 40-47500	מרכיב של מאגר FACS