טכניקה לפיתוח זיהום טפיל באורגנואידים במעיים באמצעות מיקרו-הזרקה

תקציר

מקור: Dutta, D., et al. Learning Cryptosporidium Infection in 3D רקמות נגזר רקמות אנושיות תרבית תרבית על ידי Microinjection. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים טכניקת מיקרו-הזרקה לפיתוח מודל זיהום אורגנואיד מעיים אנושי. שלב sporozoite זיהומיות של הטפיל Cryptosporidium parvum מוזרק מיקרו לתוך לומן אורגנואידי. עם פלישת תאי האפיתל של האורגנואיד, הוא עובר רבייה א-מינית ומינית כדי להשלים את מחזור חייו ומפיץ את הזיהום.

פרוטוקול

1. טיהור חוץ גופי של ספורוזואיטים מביציות C. parvum

1. לטהר sporozoites מ C. parvum ביציות לאחר הלבנה ושטיפת אקונומיקה כמתואר לעיל.
   1. מעבירים את הביציות לצינור של 15 מ"ל. להשהות ביציות בטמפרטורת החדר excystation medium (0.75% w / v נתרן taurocholate ב DMEM) כדי לקבל 1 x 10⁷ ביציות / מ"ל. תוספת של taurocholate משפר את קצב excystation של הביציות, שיפור התשואה sporozoite.
   2. יש לדגור על תרחיף ביציות בטמפרטורה של 37°C למשך 1-1.5 שעות.
   3. בדוק את הדגימה מיקרוסקופית עבור מידת excystation; 60-80% excystation סביר להחלמה טובה של sporozoites. אם רמת excystation נמוכה, לדגור יותר (עוד 30 דקות עד 1 שעה).
   4. לקבוע את אחוז excystation ביחס למספר הביציות ההתחלתיות. Excystation מחושב כ:
      % excystation = [1 – (מספר הביציות השלמות/מספר הביציות בהתחלה)] x 100
   5. לשטוף תאים כדי להסיר ריאגנטים excystation על ידי הוספת 14 מ"ל של PBS או בינוני, ערבוב, ושחזור תאים (ביציות שלמות, קליפות ביציות, sporozoites) על ידי צנטריפוגה ב 3,400 x גרם במשך 20 דקות כדי לשחזר sporozoites. שאפו בזהירות כדי להימנע מאיבוד תאים.
   6. להשהות מחדש את גלולת sporozoite ב 1-2 מ"ל של DMEM כדי לקבל 3 x 10⁷ ביציות / מ"ל (מבוסס על מספר הביציות ההתחלתיות).
   7. כדי להסיר את הביציות והקליפות שנותרו, סננו את התרחיף דרך מסנן של 3 מיקרומטר (איור 1B). השתמש במתקן מחזיק מסנן 47 מ"מ המצויד במסנן פוליקרבונט (גודל נקבוביות 3 מיקרומטר) המחובר לחבית מזרק 10 מ"ל. הניחו את מנגנון מחזיק המסנן על גבי צינור של 15 מ"ל. הניחו את המכלול בדלי קרח או בחדר קר.
   8. הוסף 7.5 מ"ל של מתלה sporozoite למכלול המסנן ולאפשר לו לסנן דרך כוח הכבידה. לשטוף עם עוד 7.5 מ"ל של DMEM.
      הערה: כדי להבטיח הצלחה בבידוד sporozoite, ביציות טריות excystation טוב הם קריטיים. אם יש יותר מדי ביציות unexcysted, המתלה לא יזרום על ידי כוח הכבידה. הפעלת לחץ על המזרק יכולה לדחוף ביציות לא מנוצצות לעבור. מיקרו-הזרקה של ספורוזואיטים מאתגרת יותר מזו של ביציות מכיוון שספורוזואיטים עלולים להתגבש ולחסום את הנימים. כדי להימנע מכך, אנו ממליצים לעשות קצה נימי רחב יותר בעת הזרקת אורגנואידים עם sporozoites. כדי להשיג רמות מספיקות של זיהום, יש להזריק פי 2-4 ספורוזואיטים לכל אורגנואיד בהשוואה לאורגנואידים הנגועים בביציות.
   9. צנטריפוגה את מתלה הספורוזואיטים המסונן ב 3,400 x גרם באמצעות רוטור דלי מתנדנד במשך 20 דקות כדי sporozoites גלולה.
   10. יש להשהות מחדש ב-50-100 μL של מדיום תרבית אורגנואידים OME או OMD (ראה טבלת חומרים) בתוספת 0.05% (w/v) צבע ירוק מהיר ו-L-גלוטתיון, בטאין, L-ציסטאין, חומצה לינולאית וחיץ מקטין המכיל טאורין (ראה טבלת חומרים).
       הערה: דגירה ממושכת מדי על ביציות עלולה לגרום לליזה של ספורוזואיטים ולהחלמה לקויה ולכן יש להימנע ממנה.

2. תרבית חוץ גופית של המעי האנושי למיקרו-הזרקה

1. אורגנואידים במעי תרבית בתנאי מדיה הרחבה והתמיינות.
   הערה: הפרטים של התפשטות המעי תוארו בעבר במאמרים אחרים (ראה טבלת חומרים למתכוני מדיה). כאן, אנו מתארים בקצרה את שיטת תרבית האורגנואידים עם התייחסות ספציפית לאופטימיזציה עבור הזרקת קריפטוספורידיום וצמיחה. מצאנו כי עבור הדמיה של טפילים באורגנואידים, אורגנואידים הגדלים בתווך התפשטות עדיפים על אלה הגדלים באמצעי התמיינות מכיוון שיש פחות הצטברות פסולת מזו הנראית באורגנואידים הגדלים בתווך התמיינות . עם זאת, אם המטרה היא לבודד ביציות, אורגנואידים הגדלים באמצעי התמיינות מייצרים מספר גבוה בהרבה של ביציות.
   1. שמור על אורגנואידים בתרביות תלת-ממדיות במטריצה חוץ-תאית (ראה טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C. הוסף OME (מדיה להרחבת אורגנואידים) מעל ורענן מדי יום.
   2. כדי לפצל ולצלחת אורגנואידים למיקרו-הזרקה, הסר מדיה מהצלחת בעלת 6 הקידוחים המכילה אורגנואידים אנושיים הוסף F12+++ (ראה טבלת חומרים) לבאר, ושבור את המטריצה על ידי פיפטציה עם קצה פיפטה 1 מ"ל מספר פעמים. לאסוף תאים לתוך צינור 15 מ"ל (2 מ"ל של F12+++ לכל צינור מספיק עבור הליכים נוספים).
   3. הוסף 10-12 מ"ל של F12+++ לצינור נוסף של 15 מ"ל והכנס צינור זכוכית מלוטש באש למדיום, פיפטה למעלה ולמטה 3 פעמים כדי לפרק את אורגנואידי המעי האנושי.
      הערה: השתמשו בצינור זכוכית ארוך (20–30 ס"מ) ולטשו אותו אש לזמן קצר. אין להפוך את הפתח (קוטר 1 מ"מ) לקטן מאוד מכיוון שאורגנואידים עלולים להינזק. הפוך את קצה הפיטה חלק על ידי ליטוש אש קצרה. שברו אורגנואידים לחתיכות קטנות יותר של ~50 מיקרומטר.
   4. הוסף F12+++ עד 5-7 מ"ל וצנטריפוגה ב 350 x גרם למשך 5 דקות.
      הערה: מהירות הצנטריפוגה בשלב זה גבוהה מהרגיל על מנת ליצור כדורית תא טובה המופרדת היטב מהמטריצה החוץ תאית (ראו טבלת חומרים). ראינו שבהשוואה לאורגנואידים של עכברים במעי הדק, קשה יותר לשבש אורגנואידים אנושיים במעי הדק.
   5. הסר כמה שיותר בינוני מבלי להפריע לתאים, ולאחר מכן להשעות מחדש את הגלולה עם מטריצה נשמר ב 4 ° C; 200-300 μL של מטריצה לכל באר של צלחת שש באר נדרש. אורגנואידים צריכים להיות מפוצלים אחד מכל שלושה כדי לשמור על צפיפות תאים גבוהה למדי.
   6. לוחים את האורגנואידים בטיפות מטריצה של כ-5-10 מיקרוליטר כל אחת בבאר של צלחת בעלת שש בארות. יש לדגור במשך 20-30 דקות בטמפרטורה של 37°C ולאחר מכן להוסיף מדיום התפשטות (OME) מלמעלה.
   7. שנה את המדיום כל 2-3 ימים.
      הערה: תוך 5-7 ימים, אורגנואידים הגדלים בקרינה אלקטרומגנטית מגיעים לגודל של 100-200 מיקרומטר ומוכנים להזרקה.
   8. כדי להבדיל בין האורגנואידים, לאחר 5-6 ימים ב- EM, שנה את המדיה לתנאי מדיה התמיינות (DM) ושמור אותה למשך 5-6 ימים נוספים לפני הזרקת הטפילים.
      הערה: להרחבת אורגנואידים, מומלץ לצלחת את האורגנואידים בצפיפות. עבור מיקרו-הזרקה, מומלץ להשתמש בצלחת בעלת שש בארות עם אורגנואידים מצופים בצפיפות נמוכה יותר. לדוגמה, אורגנואידים צלחת משלוש בארות של צלחת שש בארות לתוך צלחת מלאה שש בארות עבור microinjections. יש לשמור על מטריצה בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך ולהפשיר אותה בטמפרטורה של 4°C או על קרח לפני השימוש.

3. מיקרו-הזרקה של Oocysts/Sporozoites לתוך לומן אורגנואיד

1. הזרקת טפילים זעירים לצד האפי של האורגנואיד התלת-ממדי (איור 2).
   1. הכינו נימי זכוכית בקוטר 1 מ"מ באמצעות מושך מיקרופיפטה.
      הערה: ההגדרות המשמשות במושך מיקרופיפטה (ראה טבלת חומרים) הן חום = 663, משיכה = 100, מהירות = 200, זמן = 40 אלפיות השנייה. יהיה צורך להתאים את ההגדרות בהתאם להוראות המשתמש עבור מחשב מסוים.
   2. חותכים את קצה הנימים עם מלקחיים. גודל/קוטר קצה הנימים מודד כ-9–12 מיקרומטר; זה מאפשר זרימה קלה של ביציות (בגודל 4-5 מיקרומטר).
   3. מלאו נימים בתרחיף ביצית או ספורוזואיט באמצעות קצוות מיקרו-מעמיסים.
   4. יש להעמיס את הנימים מלאי הביציות על מיקרו-מזרק.
   5. הזריקו במיקרו תרחיף של 100–200 nL לכל אורגנואיד תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 5, תוך שמירה על לחץ קבוע. לאחר מיקרו-הזרקה, רענן את המדיה עם OME או OMD (מדיום התמיינות אורגנואידים) מדי יום ושמור על הצלחת בטמפרטורה של 37°C.
      הערה: אנחנו לא משתמשים במיקרומניפולטור למיקרו-הזרקה. שימוש באותו נימי מומלץ לכל הניסוי כדי להבטיח הזרקה שווה בכל דגימה.

תוצאות

איור 1: הכנה וטיהור של ביציות קריפטוספורידיום וספורוזואיטים. (A) ייצוג סכמטי של השיטה המשמשת להכנת ביציות וספורוזואיטים לזיהום. (B) תמונה המציגה excystation במבחנה של ביציות. סינון של ביציות unexcysted פגזים נותן פתרון מטוהר של sporozoites. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמצית קרום מרתף (מטריצה חוץ-תאית)	אמסביו	3533-010-02
ארון תקשורת Dynamag 15	תרמופישר סיינטיפיק	12301ד
ארון תקשורת Dynamag 2	תרמופישר סיינטיפיק	12321ד
מסנני קרום EMD Millipore Isopore Polycarbonate - 3 מיקרומטר	EMD-Millipore	TSTP02500
צבע ירוק מהיר	סיגמא	F7252-5G
Femtojet 4i Microinjector	אפנדורף	5252000013
נימי זכוכית בקוטר 1 מ"מ	WPI	TW100F-4
מטריג'ל (מטריצה חוץ-תאית)	קורנינג	356237
צינור מיקרופוגה 1.5 מ"ל	אפנדורף	T9661-1000EA
טיפים למיקרו-מטעין	אפנדורף	612-7933
מושך מיקרופיפטה P-97	מכשיר תריס	P-97
פנסטרפ	גיבקו	15140-122
נתרן היפוקלוריט (שימוש 5%)	קלורוקס	50371478
שקופיות סופר סטיק	Waterborne, Inc	S100-3
Swinnex-25 מחזיק מסנן פוליקרבונט 47 מ"מ	EMD-Millipore	SX0002500
חומצה טאורוקולית נתרן מלח הידרט	סיגמא	T4009-5G
טווין-20	מרק	8221840500
וורטקס ג'יני 2	תעשיות מדעיות, Inc	ת"י 0236
עו"ד+++ (DMEM+Penstrep+Glutamax+Hepes)			סכום סופי
DMEM	Invitrogen	12634-010	500 מ"ל
פנסטרפ	גיבקו	15140-122	5ml של מלאי ב 500ml DMEM
גלוטמקס	גיבקו	35050038	5ml של מלאי ב 500ml DMEM
Hepes	גיבקו	15630056	5ml של מלאי ב 500ml DMEM
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OME (מדיה הרחבה)			ריכוז סופי
א83-01	טוקריס	2,939-50 מ"ג	0.5 מיקרומטר
עו"ד+++			להכין עד 100 מ"ל
B27	Invitrogen	17504044	פי 1
EGF	פפרוטק	AF-100-15	50ng/מ"ל
גסטרין	טוקריס	3006-1 מ"ג	10 נאנומטר
NAC	סיגמא	A9125-25G	1.25mM
NIC	סיגמא	N0636-100G	10 מ"מ
Noggin CM	בבית*		10%
מעכב P38 (SB202190)	סיגמא	S7,076-25 מ"ג	10 מיקרומטר
PGE2	טוקריס	2296-10	10 נאנומטר
פרימוצין	InvivoGen	ANT-PM-1	מדיה 1 מ"ל/500 מ"ל
RSpoI CM	בבית*		20%
Wnt3a ס"מ	בבית*		50%
בבית* - קווי תאים יסופקו על פי בקשה
INTESTINAL ORGANOID MEDIA-OMD (מדיה בידול)			כדי להבדיל בין אורגנואידים, אורגנואידים מתרחבים במעי הדק גודלו בתווך עשיר ב-Wnt במשך שישה עד שבעה ימים לאחר הפיצול, ולאחר מכן גדלו בתווך התמיינות (נסיגה של Wnt, ניקוטינאמיד, SB202190, בתווך התמיינות (נסיגה של Wnt, ניקוטינאמיד, SB202190, פרוסטגלנדין E2 ממדיום עשיר ב-Wnt או OME)
הפחתת חיץ (להשעיית ביציות וספורוזואיטים להזרקה)			ריכוז סופי
L-גלוטתיון מופחת	סיגמא	G4251-10MG	0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר של OME/OMD/LOM
בטאין	סיגמא	61962	0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר של OME/OMD/LOM
ל-ציסטאין	סיגמא	168149-2.5G	0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר של OME/OMD/LOM
חומצה לינולאית	סיגמא	L1376-10MG	6.8 מיקרוגרם/מ"ל של OME/OMD/LOM
טאורין	סיגמא	T0625-10MG	0.5 מיקרוגרם/מיקרוליטר של OME/OMD/LOM