יצירת מודל עכברי של מלריה מוחית ניסיונית באמצעות ספורוזואיטים שמקורם ביתושים מארחים

תקציר

מקור: Hoffmann, A. et al., In vivo מעקב אחר התפתחות בצקת ופתולוגיה של כלי דם במודל של מלריה מוחית ניסיונית באמצעות הדמיית תהודה מגנטית.J. Vis. Exp.(2017)

סרטון זה מדגים את הדור של מודל עכבר ניסיוני של מלריה מוחית. ספורוזואיטים שבודדו מנקבות יתושים נגועות בפלסמודיום ברגהיי מוזרקות לוורידי הזנב של עכבר מרוסן, מה שמוביל להפרעה במחסום הדם-מוח ולדלקת במוח, מה שגורם למלריה מוחית. מודל עכבר נגוע זה מציע כלי רב ערך לחקר פתולוגיה מיקרו-וסקולרית in vivo הקשורה למלריה מוחית.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. זיהום

1. להדביק יתושי Anopheles stephensi עם Plasmodium berghei ANKA על ידי האכלתם במשך 15 דקות על עכבר gametocytemic. שמור על יתושים נגועים ב 80% לחות ו 21 °C (75 °F).
2. אספו נקבות יתושים מהכלוב שלהן 17 עד 22 יום לאחר ארוחת הדם. הניחו אותם על קרח כדי להרדים אותם.
3. בעזרת מלקחיים, מניחים שלושה עד ארבעה יתושים על מגלשת זכוכית מכוסה בטיפת מדיום סל"ד קר. מקם את השקופית מתחת למיקרוסקופ.
4. בעזרת מלקחיים, בזהירות למתוח את היתוש בין הראש לגוף. בודדו את בלוטת הרוק באמצעות מזרק ומחט. חזור על הליך זה עם היתושים הנותרים.
5. אספו את בלוטות הרוק משקופית הזכוכית על ידי מציצתן עם פיפטת זכוכית ואיסופן בצינור צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל.
   הערה: בהתאם לשיעורי הזיהום, בדרך כלל ניתן להשיג 8,000 עד 15,000 ספורוזואיטים זיהומיים לכל בלוטת רוק.
6. במשך כ-3 דקות, ריסקו את בלוטות הרוק המבודדות בתוך צינור הצנטריפוגה בעזרת מקל פלסטיק קטן כדי לבודד את הספורוזואיטים מרקמת בלוטת הרוק.
7. צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 1,000 x גרם ו 4 ° C כדי לטהר את sporozoites מן הרקמה הנותרת.
8. פיפטה הסופרנטנט, המכיל את הספורוזואיטים (SPZ), לצינור צנטריפוגה חדש ולספור את הספורוזואיטים המטוהרים בהמוציטומטר נויבאואר.
9. התאימו את ריכוז הספורוזואיטים המטוהרים ל-10,000/מ"ל על ידי הוספת מלח חוצץ פוספט.
10. הזריקו סך של 1,000 ספורוזואיטים (0.1 מ"ל) לתוך ורידי הזנב של עכברי C57BL/6 כדי ליזום זיהום. כדי להקל על הזריקות, הניחו את עכברי C57BL/6 בריסן והכניסו את הזנבות למים חמים (כ-37°C) כדי לסייע בהדמיה של ורידי הזנב.
    הערה: ההזרקה עצמה היא הליך קצר שניתן לבצע תוך מספר שניות.
11. פעם ביום, לבדוק פרזיטמיה בשלב הדם על מריחות דם מהיום השלישי ואילך לאחר זיהום SPZ.
12. הערך את העכברים פעם ביום עם ציון Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS), החל מהיום החמישי לאחר הזרקת הספורוזויט.
13. הערך את העכברים באמצעות דימות תהודה מגנטית (MRI) על פי ציון Rapid Murine Coma and Behavior Scale (RMCBS) ושאלת המחקר שיש להתייחס אליה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
איזופלורן	בקסטר	1001747	להרדמה
דוטארם	גברט	1086923	סוכן ניגודיות Gd-DTPA; 0.5mmol / מ"ל
אמירה (תוכנית עיבוד תמונה)	קבוצת FEI		גרסה Amira 5.3.2
MATLAB	The MathWorks, Inc.,		מהדורת 2012b
ארגז כלים FDT	ספריית התוכנה של FMRIB