הדמיה של מלכודות חוץ-תאיות במקרופאגים מנוזלי שטיפה ברונכואלבאולריים אנושיים

Abstract

מקור: Sharma, R. et al., Visualizing Macrophage Extracellular Traps using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים את התיוג החיסוני של מלכודות מקרופאגים חוץ-תאיים, METs, במקרופאגים ברונכואלבאולריים מנוזל שטיפה ברונכואלבאולרי, והדמיה שלהם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.

Protocol

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. מקרופאגים לשטיפה ברונכואלבאולרית (BAL)

1. השתמש BAL כדי להשיג מקרופאגים ריאות ב (1) נבדקים אנושיים על ידי ברונכוסקופיה, ו (2) עכברים באמצעות שאיפה intra-tracheal.
   הערה: רכישת המקרופאגים גורמת בדרך כלל להפעלה מסוימת של תאים אלה. מקרופאגים מתקבלים מחולים הזקוקים לברונכוסקופיה כדי לחקור בעיה רפואית פוטנציאלית, ולא כל הנבדקים עשויים להתאים לניתוח מלכודות חוץ-תאיות של מקרופאגים, או METs (יהיה צורך לקבוע זאת עבור כל פרויקט בנפרד).
   1. קח את תמיסת BAL וסחרר אותה כלפי מטה (500 x גרם במשך 10 דקות) ליצירת כדור, שטוף פעמיים עם מדיום תרבית (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) עם 5% נסיוב עגל עובר ו-1% L-גלוטמין) בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דלל תאים ב -4 מ"ל של מדיום תרבית.
   2. במידת הצורך, בקש ספירה דיפרנציאלית רשמית; רוב התאים (בדרך כלל >80%) יהיו מקרופאגים.
      הערה: זה יבוצע בדרך כלל על ידי שירות היסטולוגיה קלינית תוך שימוש במראה המורפולוגי של סוגי התאים השונים.
   3. בצע ספירה בת קיימא של תאי מקרופאגים בתמיסת BAL באמצעות הרחקה כחולה של טריפאן והמוציטומטר.
      הערה: תמיסת BAL מתקבלת מבני אדם ועכברים כאמור בשלב 1.1.
   4. הוסף 1 - 4 x 10⁵ מקרופאגים לצלחות 24 בארות על כיסויים ב 500 μL של מדיום תרבית לכל באר ולהשאיר לילה על 37 מעלות צלזיוס; התאים יידבקו לכיסויים. עבור דגימות אנושיות, להוסיף אנטיביוטיקה (למשל, פניצילין וסטרפטומיצין, 10⁴ U / mL) כדי למנוע זיהום חיידקי
   .

2. תיוג אימונופלואורסצנטי/מיקרוסקופיה של מקרופאגים BAL

הערה: תאים מודבקים לכיסויים כפי שהוזכר לעיל.

1. הסר את מדיום התרבית ושטוף את התאים פעם אחת עם מלוחים חוצצים פוספט (PBS). תקן תאים ב 2% paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) קיבוע במשך 10 דקות.
2. יש לשטוף תאים לזמן קצר ב-PBS, ולאחר מכן לחלחל ב-0.2% Tween 20 ב-PBS למשך 20 דקות.
3. חוסמים תאים עם 10% סרה עוף באלבומין 5% בסרום בקר (BSA) מדולל ב-PBS למשך 30 דקות.
4. יש לדגור עם נוגדנים ראשוניים ואיזוטיפ במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בריכוזים של 1:100 (פרטים ספציפיים יותר מפורטים בטבלת החומרים) בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: עבור דגימות BAL, סמן ספציפי של מקרופאגים בדרך כלל אינו נדרש.
5. לאחר הוספת נוגדנים ראשוניים, לשטוף את התאים PBS, ועוד לדגור עם נוגדנים משניים המתאימים במשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.
6. שטפו את המקטעים ב-PBS והרכיבו אותם עם אמצעי הרכבה מבוסס DAPI לצורך הדמיה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (כפי שהוזכר לעיל) בעירור לייזר 405, 488, 561 ו-647 ננומטר ומטרת שמן 40X, 1.0 NA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
דגימות אנושיות: נוגדנים ראשוניים
ארנב אנטי אנושי H3Cit (ציטרולין R26)	אבקאם	AB5103	10 מ"ג/מ"ל
עכבר MMP9 אנטי-אנושי	נובוס ביולוגי	AB119906	1:200 מיימת, לא ניתן ריכוז
ארנב אנטי אנושי PADI2/PAD2	אבקאם	AB16478	7 מ"ג/מ"ל
עכבר נגד בני אדם PADI4/PAD4	אבקאם	AB128086	10.1 מ"ג/מ"ל
נוגדנים משניים
עוף נגד ארנב AF 488/	טכנולוגיות חיים	A-21441
עוף נגד ארנב AF 594	טכנולוגיות חיים	A-21442
עוף נגד עיזים AF 594	טכנולוגיות חיים	A-21468
עוף נגד עכבר AF488	טכנולוגיות חיים	A-21200
תוכנות
אימריס	ביטפליין
תמונה J	NIH
לעוצמה ממוצעת של פלואורפורים ניתן להשתמש ביישום משרדי סטנדרטי כמו Microsoft Excel
מיקרוסקופים
C1 מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי	ניקון
מיקרוסקופ סריקה קונפוקלי FV1200	אולימפוס
דגימות BAL אנושיות מסוויטת הברונכוסקופיה במרכז הרפואי מונאש
מדיה
סל"ד	סיגמא-אולדריץ'	₪2258
נסיוב עגל עוברי	סיגמא-אולדריץ'	F0926
ל-גלוטמין	סיגמא-אולדריץ'	G7513
ריאגנטים אחרים
paraformaldehyde/periodate/lysine (PLP) fixative	סיגמא-אולדריץ'	27387
פורמלין טבעי	סיגמא-אולדריץ'	42904
Coverslips 12 מ"ל	סיגמא-אולדריץ'	S1815
Coverslips 60 x 24 מ"ל	סיגמא-אולדריץ'	C6875