טכניקת חיסון ריסוס לביסוס זיהום פטרייתי בעלי צמח האורז

תקציר

מקור: Zhang, M., et al. בדיקת זיהום צמחים: ריסוס וחיסון בתיווך פצע עם פתוגן הצמח Magnaporthe Grisea. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים טכניקה לביסוס זיהום הפטרייה הפתוגנית Magnaporthe grisea בעלי צמח האורז. תרחיף הקונידיה הפטרייתי מרוסס על חלקים של עלה אורז, והתקדמות המחלה מוערכת על ידי ניקוד היווצרות נגעים נמקיים.

פרוטוקול

1. ריסוס חיסון עם תרחיף של M. grisea Conidia

1. תרבית פטרייתית עבור M.grisea
   1. הכינו את מדיום תרבית עגבניות שיבולת שועל (OTA) לזנים פטרייתיים.
   2. שוקלים 30 - 50 גרם שיבולת שועל, מוסיפים את זה ל 800 מ"ל מים מזוקקים/נטולי יונים, (ddH₂O), ומרתיחים את התערובת במשך 30 דקות בסיר החשמלי.
   3. מסננים את מיץ שיבולת השועל המבושלת לתוך הכד דרך חתיכת גזה.
   4. מוסיפים 150 מ"ל מיץ עגבניות ו-20 גרם אגר לתסנין שבכוס ומוסיפים ddH₂O עד 1,000 מ"ל.
2. הכנת חומרים ניסיוניים
   1. השרו כ-50 זרעי אורז (Oryza sativa) זן Lijiangxintuan-heigu (LTH) ב-ddH₂O במשך 3 ד' או השרו כ-50 זרעי שעורה (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ב-ddH₂O במשך כ-1 ד'.
   2. עוטפים את זרעי האורז או השעורה בגזה לחה ונובטים אותם על נייר סינון לח בכ -30 צלחות פטרי בקוטר של 10 ס"מ x 10 ס"מ ב 28 מעלות צלזיוס. זמן נביטת זרעי האורז הוא בערך 2 - 3 ד', וזמן נביטת זרעי השעורה הוא כ -2 ד'. הלחות היחסית בחממה היא כ -70%.
   3. לשתול את שתילי האורז או השעורה בעציצים באמצעות אדמת עציץ autoclaved השקיה ולאחר מכן לכסות אותם עם שכבה של vermiculite.
   4. מניחים את הצמחים בבית זכוכית מתאים או ארון צמיחה ב 25 ° C במשך כ 1 ~ 2 שבועות.
   5. חותכים 3 שכבות של נייר סינון במעגלים עם מספריים כירורגיים סטריליים (כל עיגול צריך להיות בקוטר 8 ס"מ) ומניחים אותם על לוחות פלסטיק סטריליים 100 מ"מ.
   6. הוסיפו ddH₂O לכל צלחת כדי להשרות את נייר הסינון.
   7. ודאו שנייר הסינון רטוב לחלוטין אך לא הוסיפו מים נוספים.
   8. הסירו את עודפי המים בעזרת משאבת ואקום.
   9. הכניסו 2 קיסמים סטריליים לצלחת התרבית כדי לתמוך בעלי האורז/שעורה; רווחו את הקיסמים ~ 2-3 ס"מ זה מזה.
   10. לאסוף את העלים של האורז 2 שבועות לאחר זריעת הזרעים או לקחת את העלים של שעורה 7 ימים לאחר זריעת הזרעים.
   11. בעזרת שתילי 4 עד 6 עלים של אורז/שעורה, חותכים את החלק התחתון של הגבעול ב~5 ס"מ מלמעלה ואוספים את העלים.
3. פרוטוקול חיסון בתרסיס
   1. תרבית את הזן הפטרייתי על לוחות OTA באינקובטור תרמוסטטי (25 מעלות צלזיוס) במשך ~ 4 ד'.
   2. הוסף ~ 2 מ"ל של ddH₂O באמצעות פיפטה 0.5 - 5 מ"ל לכל צלחת בת 4 ימים.
   3. בעזרת לולאת חיסון, מגרדים את התפטיר של זן הבר M. grisea ואת הזן המוטנטי לפסולת תפטיר.
   4. אספו את שאריות התפטיר והעבירו אותו לצלחת OTA חדשה. קחו את שאריות התפטיר והתייבשו על הספסל הנקי.
   5. מכסים את הצלחת עם 3 שכבות של גזה כדי להבטיח את הלחות הנדרשת לצמיחה של conidia בחממה ב 25 °C (75 °F) במהלך היום (14 שעות) ו 23 °C בלילה (10 שעות) במשך 24 - 48 שעות.
   6. מוסיפים 2 מ"ל של ddH₂O לכל צלחת ומגרדים את הקונידיה בעדינות עם מקלוני צמר גפן סטריליים ולאחר מכן סינון דרך 2 שכבות של נייר עדשה. היזהרו לא לגרד את פני השטח של מדיום התרבות.
   7. מעבירים את מתלה הקונידיה לצינור חדש של 50 מ"ל עם פיפטה של 100 - 1,000 מיקרוליטר.
   8. צנטריפוגה למשך 5 דקות במינימום של 5,000 x גרם ב-25°C.
   9. הסר את supernatant ו resuspend את הגלולה לתת 2 x 10⁴ conidia לכל מ"ל בתמיסת 0.025% (v/v) Tween-20. הפתרון Tween-20 הוא בדרך כלל על 10 - 20 מ"ל.
   10. יוצקים את מתלה הנבג לתוך מרסס ידני.
   11. מעקרים כ -10 מ"ל של התרחיף הקונידיאלי על עלי האורז של שתילי אורז בני שבועיים או עלי שעורה של שתילי שעורה בני 7 ימים ודגרים עליהם ב 25 מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח במשך ~ 24 שעות. רססו את צמחי הבקרה בתמיסת Tween-20 0.025% (v/v).
   12. מעבירים את העלים לתא לח אחר תחת אור פלואורסצנטי ב 25 ° C למשך תקופת צילום של 12 שעות.
   13. רשום את תסמיני המחלה ב 5 d לאחר החיסון. בדוק את להבי האורז / שעורה החולים באורך ~ 6 ס"מ. תקן ההערכה הוא על פי שיטת הניקוד לעמידות בפני הדף של המכון הבינלאומי לחקר האורז (IRRI). פרטי שיטת הניקוד לעמידות בפני הדף מוצגים בטבלה 1.
   14. צלמו את העלים כדי להעריך את זיהום הזנים שנבדקו. הזיהום הוערך על ידי מספר הנגעים לכל 3.6 ס"מ².

טבלה 1: שיטת ניקוד לעמידות בפני פיצוץ. הטבלה מצוטטת מהמכון הבינלאומי לחקר האורז (IRRI).

סולם	תיאור
1	כתמים חומים קטנים בגודל נקודתי
2	כתמים אפורים קטנים מעוגלים עד מוארכים מעט, נמק, בקוטר של כ-1-2 מ"מ, עם שוליים חומים מובהקים. נגעים נמצאים בעיקר על העלים העליונים
3	סוג הנגע זהה ל-2, אך מספר לא מבוטל של נגעים נמצאים בעלים העליונים
4	נגעי הדף רגישים אופייניים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים פחות מ -4% משטח העלה
5	נגעי הדף רגישים אופייניים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים פחות מ 4-10% משטח העלה
6	נגעי הדף רגישים אופייניים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים פחות מ 11-25% משטח העלה
7	נגעי הדף רגישים אופייניים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים פחות מ 26-50% משטח העלה
8	נגעי הדף רגישים אופייניים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים פחות מ 51-75% משטח העלה, עלים רבים מתים
9	נגעי הדף רגישים טיפוסיים, 3 מ"מ או יותר, מדביקים יותר מ-75% משטח העלה

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	AOBOX ביוטכנולוגיה (סין)	01-023
נייר סינון	מותג GE Healthcare (שוודיה)	10311387
צינור 50 מ"ל	CORNING (אמרסיה)	430290
צנטריפוגה	Eppendorf (אמרסיה)	5804R
טווין-20	Coolaber (סין)	CT11551-100 מ"ל
מנה תרבותית	Thermofisher (אמרסיה)	150326
0.5-5 מ"ל פיפטה	אפנדורף	4920000105
פיפטה 100-1000uL	אפנדורף	4920000083
משאבת ואקום	לייבולד	D25B
אינקובטור	ממרט	PYX313
טבעת חיסון	גריינר ביו וואן	731175