ביסוס זיהום עלי צמח האורז באמצעות חיסון פטרייתי באמצעות פציעה

תקציר

מקור: Zhang, M. et al., The Plant Infection Test: Spray and Wound-Mediated Incinulation with the Plant Pathogen Magnaporthe Grisea.J. Vis. Exp.(2018)

סרטון זה מדגים את ביסוס זיהום עלי צמח האורז באמצעות חיסון פצוע עם תפטיר Magnaporthe grisea. צינור הנבט שמקורו בנבג פטרייתי חודר לשכבת האפידרמיס, וכתוצאה מכך נוצר זיהום ברקמות ונגעים על העלים. שיטה זו מסייעת לסינון פתוטיפ ומשפרת את הבנת עמידות הצמחים להשבחה מולקולרית.

פרוטוקול

1. תרבית פטרייתית עבור M.grisea

1. הכינו את מדיום תרבית עגבניות שיבולת שועל (OTA) לזנים פטרייתיים.
2. שוקלים 30 - 50 גרם שיבולת שועל, מוסיפים את זה ל 800 מ"ל מים מזוקקים/נטולי יונים, (ddH₂O), ומרתיחים את התערובת במשך 30 דקות בסיר החשמלי.
3. מסננים את מיץ שיבולת השועל המבושלת לתוך הכד דרך חתיכת גזה.
4. מוסיפים 150 מ"ל מיץ עגבניות ו-20 גרם אגר לתסנין שבכוס ומוסיפים ddH₂O עד 1,000 מ"ל.

2. הכנת חומרים ניסיוניים

1. השרו כ-50 זרעי אורז (Oryza sativa) זן Lijiangxintuan-heigu (LTH) ב-ddH₂O במשך 3 ד' או השרו כ-50 זרעי שעורה (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ב-ddH₂O במשך כ-1 ד'.
2. עוטפים את זרעי האורז או השעורה בגזה לחה ונובטים אותם על נייר סינון לח בכ -30 צלחות פטרי בקוטר של 10 ס"מ x 10 ס"מ ב 28 מעלות צלזיוס. זמן נביטת זרעי האורז הוא בערך 2 - 3 ד', וזמן נביטת זרעי השעורה הוא כ -2 ד'. הלחות היחסית בחממה היא כ -70%.
3. לשתול את שתילי האורז או השעורה בעציצים באמצעות אדמת עציץ autoclaved השקיה ולאחר מכן לכסות אותם עם שכבה של vermiculite.
4. מניחים את הצמחים בבית זכוכית מתאים או ארון צמיחה ב 25 ° C במשך כ 1 ~ 2 שבועות.
5. חותכים 3 שכבות של נייר סינון במעגלים עם מספריים כירורגיים סטריליים (כל עיגול צריך להיות בקוטר 8 ס"מ) ומניחים אותם על לוחות פלסטיק סטריליים 100 מ"מ.
6. הוסיפו ddH₂O לכל צלחת כדי להשרות את נייר הסינון.
7. ודאו שנייר הסינון רטוב לחלוטין אך לא הוסיפו מים נוספים.
8. הסירו את עודפי המים בעזרת משאבת ואקום.
9. הכניסו 2 קיסמים סטריליים לצלחת התרבית כדי לתמוך בעלי האורז/שעורה; רווחו את הקיסמים ~ 2-3 ס"מ זה מזה.
10. לאסוף את העלים של האורז 2 שבועות לאחר זריעת הזרעים או לקחת את העלים של שעורה 7 ימים לאחר זריעת הזרעים.
11. בעזרת שתילי 4 עד 6 עלים של אורז/שעורה, חותכים את החלק התחתון של הגבעול ב~5 ס"מ מלמעלה ואוספים את העלים.

3. פצע חיסון עם קוביות תפטיר או טיפות של תרחיף קונידיאלי של M. grisea

1. בעזרת מחט אנטומית מגרדים שלושה פצעים באורך 2-3 ס"מ בוורידים הראשיים של עלי אורז/שעורה מנותקים; נזהרים שלא לחדור לעלים.
2. הניחו את העלים המרוטשים על קיסמים וריססו תמיסת Tween-20 של 0.02% (v/v) על העלים ליצירת שכבה של טיפות.
3. חותכים פקק תפטיר בגודל 0.5 ס"מ x 0.5 ס"מ לכל זן M. grisea (זן פראי, מוטנטי, משלים או זני בדיקה אחרים) מצלחת OTA.
4. שים את תקעי התפטיר או טיפות 25 μL של תרחיף קונידיאלי על העלים הפצועים ודגר על העלים ב 25 ° C בתא לח במשך 3 - 8 d.
5. בדוק את הנגעים ב 5 - 7 d לאחר החיסון. שיטת הבדיקה זהה לשיטת החיסון בתרסיס (ראה שלב 1.3.13).
6. בדוק את להבי האורז / שעורה החולים באורך ~ 6 ס"מ וצלם אותם כדי להעריך את זיהום הזנים הנבדקים. הזיהום הוערך על ידי מספר הנגעים לכל 3.6 ס"מ².

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אגר	AOBOX ביוטכנולוגיה (סין)	01-023
נייר סינון	מותג GE Healthcare (שוודיה)	10311387
טווין-20	Coolaber (סין)	CT11551-100 מ"ל
מנה תרבותית	Thermofisher (אמרסיה)	150326
משאבת ואקום	לייבולד	D25B
מחט דיסקציה	FST	26000-35
אינקובטור	ממרט	PYX313