מערכת מדווח וירוסים רקומביננטי במבחנה לזיהוי זיהום ויראלי

תקציר

מקור: Nishitsuji, H., et al. פיתוח מערכת מדווח וירוס הפטיטיס B כדי לפקח על השלבים המוקדמים של מחזור השכפול. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לזיהוי זיהום בנגיף הפטיטיס B (HBV) באמצעות מערכת דיווח HBV רקומביננטית. כאשר הגנום הנגיפי הרקומביננטי מדביק תאים מארחים, הוא מבטא את האנזים luciferase reporter, אשר מייצר ביולומינסנציה עם חמצון המצע שלו - מה שעוזר לזהות זיהום נגיפי.

פרוטוקול

1. ייצור HBV רקומביננטי המקודד את חלבון הכתב

1. הכנת תאי HepG2
   1. הכינו מדיום תרבית תאים (Dulbecco's Engineified Eagle's Medium או DMEM) בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי (FBS), 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ו-100 U/ml חומצות אמינו לא חיוניות).
   2. צלחת 4 x 10⁶ תאי HepG2 בכלי מצופה קולגן 10 ס"מ ב 10 מ"ל של מדיום תרבית יום לפני transfection. לדגור על תאי HepG2 בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לח של 5% CO₂.
      הערה: כאשר כ 4 x 10⁶ תאי HepG2 מצופים בכלי מצופה קולגן 10 ס"מ ב 10 מ"ל של מדיום תרבית, הם יהיו 70-90% מפגש למחרת.
2. טרנספקציה
   1. Transfect HepG2 cells עם 5 מיקרוגרם של pUC1.2HBV (וירוס הפטיטיס B) דלתא אפסילון ו 5 מיקרוגרם של pUC1.2HBV/NL15 באמצעות מגיב transfection בהתאם להוראות היצרן.
   2. למחרת, להסיר את מדיום התרבות ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום תרבית טרי.
   3. שבוע לאחר הטרנספקציה, העבירו את מדיום התרבית המכיל את HBV הרקומביננטי לשפופרת של 50 מ"ל והמשיכו לשלב 1.3.1. מוסיפים 10 מ"ל של מדיום תרבית טרי לצלחת המכילה את התאים הנגועים.
      הערה: הייצור של HBV רקומביננטי נשמר במשך 4 שבועות. ניתן לאחסן את מדיום התרבית המכיל HBV רקומביננטי ב 4 ° C למשך חודש אחד.
3. טיהור HBV רקומביננטי
   1. הסר פסולת תאים ממדיום התרבית המכיל HBV רקומביננטי באמצעות צנטריפוגה (2,300 x גרם למשך 5 דקות).
   2. מעבירים את הסופרנאטנט דרך מסנן ממברנה של 0.45 מיקרומטר.
   3. יש להוסיף נפח שווה של 26% PEG/1.5 M NaCl (פוליאתילן גליקול 6000: 130 גרם, NaCl, 49 גרם, 1 מ"ל של 0.5 M EDTA (חומצה אתילאנדיאמיןטטראצטית) pH 8.0 ו-5 מ"ל של 1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) (pH 7.6 in 500 ml) למדיום התרבית המכיל HBV רקומביננטי ולערבב בעדינות. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
   4. צנטריפוגה ב-2,300 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C.
   5. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהמיס את הגלולה ב-0.5 מ"ל TNE (10 מ"מ טריס (טריס (הידרוקסימתיל)אמינומתאן), 50 מ"מ NaCl, 1 מ"מ EDTA).
   6. הסר את הפסולת באמצעות צנטריפוגה במהירות של 2,300 x גרם למשך 5 דקות.
   7. יש להעמיס 0.5 מ"ל של TNE המכיל HBV רקומביננטי על 0.8 מ"ל של 20% סוכרוז ב-TNE.
   8. צנטריפוגה ב 100,000 × גרם במשך 3 שעות ב 15 ° C.
   9. השליכו כמה שיותר מהסופרנאטנט, ושמרו את הכדור. להשעות אותו ב 1 מ"ל של DMEM ללא סרום לכל 40 מ"ל של מדיום תרבית התחלתי.
   10. לדגור לילה ב 4 °C (75 °F).
   11. סנן דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. להכין 0.5 מ"ל aliquots ולאחסן ב -80 °C.
       הערה: אם נצפה זיהום בחלבון הכתב של דגימת הנגיף המקורית, יש לטהר את הנגיף על ידי צנטריפוגה אולטרה-צנטריפוגה הדרגתית של 5-30% סוכרוז ב-TNE ב-100,000 x גרם למשך שעתיים, או צנטריפוגה שוות משקל בצפיפות CsCl מ-1.1-1.6 גרם/מ"ל ב-150,000 x גרם למשך 50 שעות.

2. זיהום של HBV רקומביננטי

1. תרבית תאי HepG2 המבטאים ביציבות NTCP (נתרן טאורוכולט מוביל פוליפפטיד משותף) (HepG2/NTCP) הרגישים לזיהום HBV ב- DMEM בתוספת 10% FBS, 100 U/ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 250 מיקרוגרם / מ"ל G-418 (גנטיקה) ו 100 U / ml חומצות אמינו לא חיוניות ב 37 ° C באינקובטור לח 5% CO₂.
2. יום לפני ההדבקה, צלחת כ 5 x 10⁴ תאי HepG2 / NTCP לתוך צלחת מצופה קולגן 96 באר ב 0.1 מ"ל של מדיום תרבית.
3. הפשירו HBV רקומביננטי באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שיישאר מעט קרח בבקבוקון.
4. הכן את המדיום לזיהום על ידי שילוב הדברים הבאים:10 μl של 40% PEG8000 במי מלח חוצצים פוספט (PBS), 2 μl של dimethyl sulfoxide (DMSO), 10 μl של HBV רקומביננטי, ו 78 μl של מדיום תרבית טרי לכל באר של צלחת 96 באר
.
5. הוסף 100 μl של תמיסת HBV רקומביננטית לבאר אחת של צלחת 96 בארות.
6. יום לאחר ההדבקה, שטפו את התאים הנגועים 3 פעמים עם 300 μl PBS לכל באר כדי להסיר את חלבון הכתב המזהם מחלק הנגיף.
7. לדגור על תאים נגועים ב 200 μl של מדיום תרבית המכיל 2% DMSO במשך שבוע או פחות.

3. ניתוח

1. שבוע לאחר ההדבקה, לשטוף את התאים הנגועים 3 פעמים עם PBS.
2. הוסף 50 μl של חיץ ליזיס לתאים הנגועים.
3. רוק את צלחת התרבית במשך 5 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה ב 2,000 x גרם במשך 5 דקות.
4. הוסף 50 μl של מצע הכתב לתוך לוח luminometer.
5. הוסף 20 μl של ליזט התא ללוח לומנומטר המכיל את מצע הכתב. מערבבים על ידי ערבוב קצר.
6. מניחים את הצלחת בלומינומטר ומתחילים את הקריאה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Nano-Glo Luciferase Assay Regent	פרומגה	N1110
תמיסה מעורבת פניצילין-סטרפטומיצין	Nacalai tesque	09367-34
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות MEM	תרמו פישר סיינטיפיק	11140050
DMEM	תרמו פישר סיינטיפיק	11995065
Opti-MEM I סרום מופחת בינוני	תרמו פישר סיינטיפיק	31985070
צלחת 100 מ"מ/ציפוי קולגן	איוואקי	4020-010
מגיב טרנספקציה Lipofectamine 3000	תרמו פישר סיינטיפיק	L3000001
פוליאתילן גליקול (PEG) 6000	סיגמא-אולדריץ'	81255
פוליאתילן גליקול (PEG) 8000	סיגמא-אולדריץ'	89510
NaCl	Nacalai tesque	31319-45
פתרון 0.5 mol/l-EDTA	Nacalai tesque	06894-14
Tris-HCl	Nacalai tesque	35434-21
Millex-HP, 0.45 מיקרומטר, פוליאתתרסולפון, מסנן	מרק מיליפור	SLHP033RS
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)	סיגמא-אולדריץ'	D2650
צלחת 96 באר מצופה קולגן	קורנינג	NO3585
ליזה פסיבית 5xBuffer	פרומגה	E1941
GloMax 96 Microplate Luminometer	פרומגה	E6501
סוכרוז	Nacalai tesque	30403-55
צלחת לומנומטר	גריינר ביו-וואן	655075
HepG2-NTCP1-myc-clone22	-	-	Nishitsuji, H., et al. סרטן. Sci. (2015)
pUC1.2HBV דלתא אפסילון	-	-	Nishitsuji, H., et al. סרטן. Sci. (2015)
pUC1.2HBV/NL	-	-	Nishitsuji, H., et al. סרטן. Sci. (2015)
צינור 50 מ"ל	ויולמו	1-3500-02
נוגדן Anti-Myc	סיגמא-אולדריץ'	C3956
HBIG	ארגון מוצרי הדם של יפן	-
IFN-β	Mochida פרמצבטיקה	1.49872E+13
הפארין	סיגמא-אולדריץ'	H3393