כל ההליכים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE
1. פתרונות נדרשים
- הכינו 150 מ"ג/ליטר (להרדמה) או 300 מ"ג/ליטר (להמתת חסד) של תמיסת אתיל 3-אמינובנזואט מתאן-סולפונט (MS-222) עם מים מהאקווריום שבו מוחזקים דגי הזברה. מלאו מיכל קטן בליטר אחד של תמיסת הרדמה ושמרו אותו מאוורר.
- מלא מיכל קטן נוסף עם 1 ליטר של מי אקווריום ללא MS-222 להתאוששות דגים ולשמור אותו מאוורר.
- הפוך 50 מ"ל של PBS 1x מתמיסת מלאי סטרילית פי 10.
- לניתוח ציטומטריה/בידוד תאי מעיים, הכינו מספיק תמיסת 0.15% קולגנאז סוג IV טרייה עבור 1 מ"ל לדג מתמיסת ציר או מאבקה בתווך הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם 1% v/v פניצילין וסטרפטומיצין (ראו חומרים). הפוך aliquots (1 לכל דג) של 1 מ"ל ב 2 מ"ל צינורות צנטריפוגה. יש לשמור על טמפרטורה של 4°C עד 30 דקות לפני שלב הנתיחה.
- לקיבוע מיקרוסקופיה קונפוקלית/דגימה, הכינו 50 מ"ל של תמיסת פרפורמלדהיד (PFA) טרייה ב-PBS או הפשירו תמיסת ציר ממקפיא בטמפרטורה של -20°C במכסה אדים.
זהירות: PFA הוא רעיל. אנא קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים לפני העבודה איתו. יש ללבוש כפפות ומשקפי בטיחות, ותמיד להשאיר פתרונות בתוך מכסה אדים.
2. הכנת הציוד לאינטובציה אוראלית
- הניחו כ-1 ס"מ של צינור סיליקון דק על מחט נעילה 31 G Luer כדי לכסות את קצה המחט.
- חותכים קצה פיפטה מסנן סטרילי 10 μL (בסביבות 2 ס"מ), לוקחים את הקצה העדין יותר, ומניחים אותו מעל צינור הסיליקון כנדן. ודא שהפיפטה משתרעת מעבר לקצה המחט כדי למנוע פגיעה בחיה.
- חבר את המחט למזרק 100 μL Luer locke.
הערה: יש לשטוף תמיד עם אתנול ולאחר מכן עם מלח חוצץ פוספט (PBS, ראה חומרים) ביסודיות בין הטיפולים.
3. הכנת תרחיף ננו-חלקיקים פלואורסצנטי
- תייג את חלקיק החלבון עם Atto-488 NHS ester (ראה טבלת חומרים) או צבע פלואורסצנטי מתאים בהתאם להוראות היצרן.
- השהה מחדש את הננו-חלקיקים במאגר נתרן ביקרבונט 0.1 M בריכוז של 2 מ"ג/מ"ל.
- יש להמיס את Atto 488 NHS ester בדימתיל סולפוקסיד ללא אמין (DMSO) במינון של 2 מ"ג/מ"ל. שמור aliquot של 10 μL כדי לבדוק את יעילות התוויה.
- ערבבו את הננו-חלקיקים ואת אסטר Atto 488 NHS ביחס מולארי של 1:2 (חלבון: צבע) על ידי ערבוב בחושך.
- סובבו את הננו-חלקיקים המסומנים באמצעות צנטריפוגה במהירות של 8,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, הסירו את הסופר-נטנט ושמרו אותו כדי לבדוק את יעילות התוויה.
- שטפו את הננו-חלקיקים המסומנים על ידי השעייתם מחדש ב-1 מ"ל של חיץ נתרן ביקרבונט 0.1 מ' על ידי ערבול וצינוק מעלה ומטה. לאחר מכן השליכו את הסופרנאטנט על ידי צנטריפוגה במהירות של 8,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 3.6 במשך 5 פעמים.
- להשהות מחדש את הגלולה ב 5 מ"ל של 0.1 M סודיום ביקרבונט חיץ בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ולעשות aliquots של חלקיק פלואורסצנטי בצינורות צנטריפוגה 1.5 מ"ל (30 aliquots). יש לסחור מטה בטמפרטורה של 8,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, להשליך את הסופר-נטנט ולאחסן בטמפרטורה של -80°C כשהוא מוגן מפני האור.
4. הרדמה של דגי זברה ואינטובציה אוראלית
- צום הדג (>0.5 גרם) לפחות 48 שעות לפני הניסוי כדי לרוקן את המעי.
- העבירו את הדג (12 דגים) למכלי הניסוי (6 ליטר) לילה אחד לפני הניסוי כדי לאפשר התאקלמות12.
- מערבלים היטב את תמיסת הננו-חלקיקים (למשל, 2,500 סל"ד ו-30 שניות) ומושכים את הנפח הרצוי של תרחיף ננו-חלקיקים (למשל, 20-50 מיקרוליטר) לתוך המזרק המחובר למחט המוגנת.
- הניחו את הדגים בתמיסת MS-222 מאווררת בנפח 150 מ"ג/ליטר (ראו סעיף 1) עד שהם שוקעים לתחתית המיכל ואינם מגיבים לצביטת סנפיר זנב; תהליך זה אורך פחות מ-5 דקות.
- להעביר במהירות את הדג מורדם עם רשת למגש פלסטיק רטוב, לכוון את החיה אופקית מול המחט ומיד להתחיל את אינטובציה אוראלי.
- תמכו בזהירות בדגים ביד אחת ופתחו את הפה ביד השנייה באמצעות המחט המוגנת. הכנס בעדינות את המחט במורד הוושט עד כ 1 ס"מ מפתח הפה.
הערה: המפעיל עשוי להרגיש התנגדות קלה כאשר קצה פיפטה קצה עבר את הגיל. היזהרו לא לסובב את כניסת המחט יותר מדי מה שעלול לנקב את הזמיר.
- הזריקו באיטיות את תרחיף הננו-חלקיקים לתוך הדג. יש לוודא שהמתלים אינם זורמים החוצה דרך הזימים או הפה.
- הסירו בעדינות את המחט והכניסו את הדג למיכל החילוץ (ראו סעיף 1). ההתאוששות אורכת בדרך כלל דקה.
- בדוק היטב את הדג עבור כל חריגה (למשל, דימום על הזימים הוא סימן של ניקוב).
- לאחר שהדגים התאוששו, החזירו אותם למכלי הניסוי.
