$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הרדמה, אינטובציה וחיסון בעלי חיים
הערה: מומלץ להשתמש בחולדות Sprague-Dawley זכרים ספציפיים ללא פתוגן (SPF) במשקל 100 - 120 גרם. לספק לכל בעלי החיים מזון ומים ולשכן אותם חברתית על שבבי עץ או מצעים סופגים אחרים עם מחזורי אור-חושך סטנדרטיים של 12 שעות.
- לפני ביצוע ניסויים כלשהם, להשיג ולעקר צינורית מתכת צינורות פוליאתילן בגודל המתאים למיני בעלי החיים. להשיג מזרקים חד פעמיים סטריליים 1 מ"ל ומחטים חד פעמיות סטריליות 25 מד.
זהירות: תמיד להשליך מזרקים ומחטים אלה במיכל חד.
- עבור חולדות, לרכוש או לייצר צינורית מתכת כי הוא כ 12 ס"מ אורך, יש מזהה של 0.9 - 1.0 מ"מ OD של 1.0 - 1.2 מ"מ והוא כפוף לזווית משוערת 45° בקצה אחד. חתכו צינור פוליאתילן באורך 11 עד 12 אינץ' עם מזהה של 0.4 מ"מ ו-OD 0.8 מ"מ. (עיין באיור 1A.)
- הניחו את צינורית המתכת בצינור זכוכית, פקק בורג ואוטוקלאבה בשיטות סטנדרטיות לעיקור. משרים ומאחסנים את צינורות הפוליאתילן בכוס מכוסה המכילה אלכוהול.
- הכינו את משטח העבודה ואת מכשיר האינטובציה.
- הניחו שטיחון חד פעמי ונקי על משטח העבודה, קרוב לאמבט המים. מעבירים את צינורית המתכת, בצינור אחסון הזכוכית שלה, למשטח זה. הסר את הפקק מצינור האחסון והחלק את קצה "הידית" של הצינורית לקצה הפתוח של הצינור
.
- בעזרת מלקחיים סטריליים, הסר צינור פוליאתילן באורך אחד מהכד והכנס אותו דרך החלק הפנימי של צינורית המתכת הסטרילית, תוך הקפדה על תנועה חופשית. הכנס מחט חד פעמית סטרילית של 25 מד (לחולדות) על הקצה החופשי של צינור הפוליאתילן על ידי החלקת המחט כמה מ"מ לתוך הצינור. (ראו איור 1A עבור חולדה).
- הניחו סימנים מנחים הן על צינורית המתכת והן על צינורית הפוליאתילן כדי לציין את עומק ההחדרה לבעל החיים על ידי ביצוע הליך האינטובציה המתואר להלן על בעל חיים בודד שעבר המתת חסד. פתח את חלל החזה לתצפית, ולאחר מכן מקם את צינורית המתכת כראוי וקדם את צינור הפוליאתילן כראוי. בעזרת עט בל בל יימחה, סמנו את צינורית המתכת במקום בו היא פוגשת את פיה של החיה ואת צינורית הפוליאתילן במקום בו היא פוגשת את החלק העליון של צינורית המתכת כדי לסייע במיקום נכון בבעלי החיים הנותרים.
- בתוך מכסה אדים (או באמצעות מערכת נבלות מתאימה), מרדימים עד 6 בעלי חיים בכל פעם בתא סגור המסופק עם ≤5% איזופלורן בחמצן של 1.5 ליטר/דקה עד לרפלקס ההקאה (כדקה).
הערה: לפני ביצוע ניסויים כלשהם, קבע את המינון הבטוח ואת זמן החשיפה לאיזופלורן בתנאים הספציפיים שבהם נעשה שימוש (למשל גודל/סוג החדר וגודל/מין/זן של בעל חיים) כדי למנוע חשיפה קטלנית בשוגג .
- מלאו מזרק חד פעמי סטרילי בנפח 1 מ"ל (לחולדות) במי מלח סטריליים על ידי הכנסת הקצה הסטרילי לתוך המלח ומשכו אותו בחזרה על הבוכנה. חברו את המזרק למחט המותקנת על צינור הפוליאתילן ושטפו את כל נפח המלח דרך הצינורית עד לריקון המזרק.
- מלאו את המזרק באינקולום על בסיס אגר מהמיכל באמבט המים, ושטפו את האגר דרך הצינור עד שהצינור מוכן (למשל מלא לחלוטין באגר).
- עבור חולדות, הסר את המחט בעלת 25 המד (המותקנת על צינור הפוליאתילן) מהמזרק החד פעמי. יש להשליך את המזרק המשומש למיכל חדים. מלאו מזרק חד פעמי חדש וסטרילי בנפח 1 מ"ל באינוקולום על בסיס אגר מהמיכל באמבט המים על ידי הכנסת הקצה הסטרילי לתוך האינקולום ומשיכה לאחור של הבוכנה. חברו מחדש את המחט (המותקנת על צינור הפוליאתילן) ושטפו את האגר דרך הצינור על ידי לחיצה על הבוכנה רק עד שהצינורית מתמלאת לחלוטין באגר.
- הוציאו בעל חיים אחד מתא ההרדמה. הניחו את החיה במצב שכיבה על המחצלת החד-פעמית כשהראש מימין והזנב משמאל, כפי שמוצג באיור 1C.
- באמצעות מכשיר האינטובציה (כלומר, צינורית המתכת המצוידת בצינורות פוליאתילן), הכניסו את החיה לאינטובציה והכניסו את הצינורית לאונה הגדולה של הריאה השמאלית (ראו איור 1D).
- הכנס את הקצה החופשי של צינורית המתכת לפיו של החיה. סובב את הצינורית כך שהקצה החופשי יהיה בזווית כלפי מעלה וקדם אותה בעדינות לתוך קנה הנשימה, תוך עקיפת מבני הגרון בזהירות בתנועת פיתול קלה. אשרו החדרה לקנה הנשימה בניגוד לוושט על-ידי החלקה עדינה של הצינורית מעט קדימה ואחורה מספר פעמים תוך מישוש טבעות קנה הנשימה עם אצבע שמאל, כפי שמוצג באיור 1C.
- כאשר הצינורית מגיעה לביפורקציה שבה קנה הנשימה מתפצל לסמפונות השמאלית והימנית, בצע תנועה סיבובית קלה לכיוון הצד השמאלי של החיה כדי להבטיח שהצינורית תוכנס לסימפונות השמאליים. מקדמים את צינורית המתכת עד שהקצה נמצא באמצע הדרך לשלושת רבעי הריאה השמאלית, תוך שימוש בסימן המנחה שהוצב קודם לכן כדי לוודא שהושג העומק המתאים.
- כאשר צינורית המתכת במקומה, מקדמים את צינור הפוליאתילן מספר מ"מ. השתמש בסימן המנחה שהוצב קודם לכן על הצינור כדי לוודא שהוא מתקדם רק מספיק רחוק כדי לצאת מקצה צינורית המתכת ולא לנקב את הריאה.
- כאשר שתי הצינוריות במקומן, השתמשו במזרק המחובר כדי להחדיר 100 מיקרוליטר (לחולדות) של תרחיף האגר עמוק לתוך האונה הגדולה של הריאה השמאלית (ראו איור 1D). משוך כמה מ"מ של צינור פוליאתילן, ולאחר מכן בעדינות להסיר את התקן אינטובציה שלם. החזירו אותו לצינור אחסון הזכוכית והעבירו את בעל החיים לכלוב טרי כדי להתאושש.
