טכניקה לגרימת יובש אוטואימוני אוטואימוני כרוני בחולדות

תקציר

מקור: Hou, A., et al. מודל עכברוש עין יבשה אוטואימוני כרוני עם עלייה בתאי T של זיכרון אפקט ברקמת גלגל העין. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים טכניקה לגרימת מחלת עין יבשה אוטואימונית ניסיונית כרונית בחולדות. עם הזרקת תחליב אנטיגן-אדג'ובנטי המכיל אוטואנטיגנים ואנטיגנים זרים לחולדה בפרקי זמן מוגדרים מראש, דלקת עיניים כרונית נגרמת בחולדה המחוסנת על ידי הזרקת אותם אנטיגנים לרקמות פני השטח של העין.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תמצית בלוטת הדמעות

הערה: חולדות הורדמו בהזרקה תוך-צפקית של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). הרדמה נכונה אושרה על ידי צביטת בוהן וצביטה בזנב. ג'ל עיניים נמרח על עיני החולדה כדי למנוע יובש לאחר כל הליך. החולדות המורדות הונחו תחת אורות אינפרא אדום מרוחקים כדי לשמור על חום בעלי החיים עד להחלמה מלאה. במהלך ההליכים וזמן ההתאוששות, בעלי החיים היו תחת מעקב צמוד על ידי החוקרים. כל החומרים וכלי הניתוח היו סטריליים לפני השימוש. בסוף הניסוי, חולדות הומתו על ידי הזרקה intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג). המתת חסד מלאה אומתה על ידי חוסר דופק לב וללא רפלקס מצמוץ על ידי נגיעה בגלגל העין. חולדות שוכנו בתנאים סטנדרטיים: טמפרטורת החדר, 21-23 מעלות צלזיוס; לחות יחסית, 30-70%; מחזור אור-חושך, לסירוגין 12 שעות (7 בבוקר עד 7 בערב).

1. הניחו את נקבת חולדות ספראג-דולי (טווח הגילאים שבין 8 שבועות ל-16 שבועות) שטוחות, כשאוזן אחת צמודה לשולחן והשנייה פונה כלפי מעלה. בצע חתך 10 מ"מ עליון - נחות מתחת לאוזן החשופה עם זוג מספריים קפיציים. הסר את בלוטת הדמעות על ידי חתך אותה מרקמת החיבור שמסביב ומתעלת הניקוז.
   1. יש לאחסן את הבלוטות בטמפרטורה של -80°C עד לצורך. הפשירו את הבלוטות על קרח. טחון דק ככל האפשר על קרח עם מספריים. הוסף 150 μL של PBS עם מעכב פרוטאז 1x לכל בלוטת דמעות.
2. בצעו את הדגימות על קרח למשך 5 דקות ב-20 קילו-הרץ כאשר הסוניקטור מכוון ל-10 שניות דולקות, ו-10 שניות כבויות באמפליטודה של 30%. צנטריפוגה את הדגימות הסוניק במשך 20 דקות ב 13,000 x גרם ו 4 ° C.
3. פיפטה את supernatant ולהעביר אותו צינור חדש. Aliquot supernatant לצינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותם ב -80 ° C. למדוד את ריכוז החלבון עם בדיקת חומצה bicinchoninic, בהתאם להוראות היצרן.

2. הכנת רעלן תחליב ושעלת

1. אמולסיה
   1. הוסף 40 מ"ג של Mycobacterium tuberculosis H37Ra שהומת בחום לתוך 10 מ"ל של אדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל 1 מ"ג / מ"ל Mycobacterium tuberculosis H37Ra וערבב היטב.
      הערה: האדג'ובנט השלם הסופי של פרוינד מכיל 5 מ"ג/מ"ל Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
   2. שוקלים את האובלבומין, ממיסים אותו ב-PBS ומכינים תערובת אנטיגן המכילה 2 מ"ג/מ"ל אובלבומין ו-10 מ"ג/מ"ל תמצית בלוטת הדמעות. במטרה להגיע לנפח הזרקה של 200 μL לכל חיה, הכינו תערובת מאסטר המבוססת על מספרי בעלי החיים.
   3. מעבירים אדג'ובנט לא שלם של פרוינד או אדג'ובנט שלם של פרוינד לצינורית של 50 מ"ל, ומוודאים שנפח האדג'ובנט לתערובת האנטיגן הוא ביחס של 1:1. מוסיפים את תערובת האנטיגן טיפה אחר טיפה לאדג'ובנט תוך כדי ערבול במהירות הגבוהה ביותר, כך שלא תגרום לשפיכה. ממשיכים לערבל במשך 5 דקות לאחר הוספת כל האנטיגן.
   4. מעבירים את התחליב למזרק 5 מ"ל ומחברים אותו למזרק 5 מ"ל נוסף דרך מחבר מזרק. דוחפים את התחליב ממזרק אחד לשני כדי לערבב אותו.
      הערה: האמולסיה מוכנה אם טיפה אחת נשארת ככדור כאשר היא מונחת במים. יש להשתמש רק בתחליב או תחליב טריים המאוחסנים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
2. רעלן שעלת
   1. הרכיבו מחדש 50 מיקרוגרם של רעלן שעלת ב-500 מיקרוליטר מים כדי להגיע לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרוליטר. ווטקס את המיכל למשך 30 שניות כדי לוודא שהרעלן מתמוסס לחלוטין.
      הערה: אין לעקר על ידי סינון, שכן הדבר יגרום לאובדן חומר. אין להקפיא. תמיסה זו נשארת פעילה לפחות 6 חודשים ב 4 °C (75 °F).
   2. יש לדלל 100 נ"ג/מיקרוליטר של רעלן שעלת ל-3 נ"ג/מיקרוליטר באמצעות PBS. מעבירים 100 μL של רעלן השעלת המדולל למזרק הזרקת Luer-lock 1 מ"ל עם מחט 27 גרם.

3. חיסון חולדות לואיס

1. ביום 0, מערבבים את התחליב כמה פעמים. יש לפזר 200 מיקרוליטר של תחליב, המכיל 1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו-200 מיקרוגרם אובאלבומין באדג'ובנט שלם של פרוינד, למזרקי Luer-lock בנפח 1 מ"ל עם מחטים של 27 גרם. הזריקו את התחליב באופן תת עורי בבסיס זנבות החולדות ללא הרדמה.
   הערה: אין צורך לחמם את הזנב מראש לפני ההזרקה. כל חולדה מחוסנת ב-1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו-200 מיקרוגרם אובלבומין באדג'ובנט מלא של פרוינד עם 500 מיקרוגרם של Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
2. ביום ה -14, הזריקו 200 מיקרוליטר של התחליב, המכיל 1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו -200 מיקרוגרם של אובלבומין באדג'ובנט של פרוינד לא שלם, באותו אופן כמו ביום 0. הזריקו 300 ננוגרם של רעלן שעלת ב-100 מיקרוליטר של PBS תוך צפקית לכל חולדה באותו יום.

4. הזרקת תערובת האנטיגן לתת-הלחמית הקדמית ולבלוטת הדמעות כדי לגייס תאי חיסון ספציפיים לאנטיגן ולגרום לדלקת מקומית

1. חשב את כמות ovalbumin ותמצית בלוטת הדמעות מבוסס על מספר החולדות בניסוי. שקול את הכמות הנדרשת של ovalbumin ולשלב אותו עם תמצית בלוטת הדמעות מופשרת מוכן בשלב 1, מה שהופך פתרון אנטיגן המכיל 1 מ"ג / מ"ל ovalbumin ו 1 מ"ג / מ"ל בלוטת הדמעות לחלץ.
2. מרדימים את החולדות עם קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תוך צפקית. צבטו את אצבעות רגליהן של חולדות כדי להבטיח שהושגה הרדמה נאותה (כלומר, לא נצפתה תנועה מגיבה לאחר הצביטה). להזריק 5 μL של אנטיגן לתוך תת הלחמית forniceal של העין. להזריק 20 μL של אנטיגן לתוך בלוטת הדמעות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ריאגנטים
קוקטייל מעכב פרוטאז	סיגמא-אולדריץ'	P2714-1BTL
ערכת בדיקת חלבון פירס BCA	מדע תרמי	23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	בקטון, דיקינסון והחברה	231141
להשלים את האדג'ובנט של פרוינד	בקטון, דיקינסון והחברה	231131
אובאלבומין	סיגמא-אולדריץ'	A5503-10G
האדג'ובנט של פרוינד לא שלם	סיגמא-אולדריץ'	F5506-6X10ML
רעלן שעלת	סיגמא-אולדריץ'	P7208-50UG
תמיסת נתרן פלואורסצאין	Bausch & Lomb U.K מוגבלת	נה
ציוד
סוניקטור	סוניקס	תא ויברה
מיקרוסקופ מיקרו IV	מעבדות המחקר של פיניקס	נה