כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. הכנת תמצית בלוטת הדמעות
הערה: חולדות הורדמו בהזרקה תוך-צפקית של קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). הרדמה נכונה אושרה על ידי צביטת בוהן וצביטה בזנב. ג'ל עיניים נמרח על עיני החולדה כדי למנוע יובש לאחר כל הליך. החולדות המורדות הונחו תחת אורות אינפרא אדום מרוחקים כדי לשמור על חום בעלי החיים עד להחלמה מלאה. במהלך ההליכים וזמן ההתאוששות, בעלי החיים היו תחת מעקב צמוד על ידי החוקרים. כל החומרים וכלי הניתוח היו סטריליים לפני השימוש. בסוף הניסוי, חולדות הומתו על ידי הזרקה intraperitoneal של pentobarbital (80 מ"ג / ק"ג). המתת חסד מלאה אומתה על ידי חוסר דופק לב וללא רפלקס מצמוץ על ידי נגיעה בגלגל העין. חולדות שוכנו בתנאים סטנדרטיים: טמפרטורת החדר, 21-23 מעלות צלזיוס; לחות יחסית, 30-70%; מחזור אור-חושך, לסירוגין 12 שעות (7 בבוקר עד 7 בערב).
- הניחו את נקבת חולדות ספראג-דולי (טווח הגילאים שבין 8 שבועות ל-16 שבועות) שטוחות, כשאוזן אחת צמודה לשולחן והשנייה פונה כלפי מעלה. בצע חתך 10 מ"מ עליון - נחות מתחת לאוזן החשופה עם זוג מספריים קפיציים. הסר את בלוטת הדמעות על ידי חתך אותה מרקמת החיבור שמסביב ומתעלת הניקוז.
- יש לאחסן את הבלוטות בטמפרטורה של -80°C עד לצורך. הפשירו את הבלוטות על קרח. טחון דק ככל האפשר על קרח עם מספריים. הוסף 150 μL של מלח חוצץ פוספט או PBS עם מעכב פרוטאז 1x לכל בלוטת דמעות.
- בצעו את הדגימות על קרח למשך 5 דקות ב-20 קילו-הרץ כאשר הסוניקטור מכוון ל-10 שניות דולקות, ו-10 שניות כבויות באמפליטודה של 30%. צנטריפוגה את הדגימות הסוניק במשך 20 דקות ב 13,000 x גרם ו 4 ° C.
- פיפטה את supernatant ולהעביר אותו צינור חדש. Aliquot supernatant לצינורות 1.5 מ"ל ולאחסן אותם ב -80 ° C. למדוד את ריכוז החלבון עם בדיקת חומצה bicinchoninic, בהתאם להוראות היצרן.
2. הכנת רעלן תחליב ושעלת
- אמולסיה
- הוסיפו 40 מ"ג של Mycobacterium tuberculosis H37Ra שהומתו בחום ל-10 מ"ל של אדג'ובנט שלם של פרוינד המכיל 1 מ"ג/מ"ל Mycobacterium tuberculosis H37Ra וערבבו היטב.
הערה: האדג'ובנט השלם הסופי של פרוינד מכיל 5 מ"ג/מ"ל Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- שוקלים את האובלבומין, ממיסים אותו ב-PBS ומכינים תערובת אנטיגן המכילה 2 מ"ג/מ"ל אובלבומין ו-10 מ"ג/מ"ל תמצית בלוטת הדמעות. במטרה להגיע לנפח הזרקה של 200 μL לכל חיה, הכינו תערובת מאסטר המבוססת על מספרי בעלי החיים.
- מעבירים אדג'ובנט לא שלם של פרוינד או אדג'ובנט שלם של פרוינד לצינורית של 50 מ"ל, ומוודאים שנפח האדג'ובנט לתערובת האנטיגן הוא ביחס של 1:1. מוסיפים את תערובת האנטיגן טיפה אחר טיפה לאדג'ובנט תוך כדי ערבול במהירות הגבוהה ביותר, כך שלא תגרום לשפיכה. ממשיכים לערבל במשך 5 דקות לאחר הוספת כל האנטיגן.
- מעבירים את התחליב למזרק 5 מ"ל ומחברים אותו למזרק 5 מ"ל נוסף דרך מחבר מזרק. דוחפים את התחליב ממזרק אחד לשני כדי לערבב אותו.
הערה: האמולסיה מוכנה אם טיפה אחת נשארת ככדור כאשר היא מונחת במים. יש להשתמש רק בתחליב או תחליב טריים המאוחסנים למשך הלילה ב -4 מעלות צלזיוס.
- רעלן שעלת
- הרכיבו מחדש 50 מיקרוגרם של רעלן שעלת ב-500 מיקרוליטר מים כדי להגיע לריכוז סופי של 100 ננוגרם/מיקרוליטר. ווטקס את המיכל למשך 30 שניות כדי לוודא שהרעלן מתמוסס לחלוטין.
הערה: אין לעקר על ידי סינון, שכן הדבר יגרום לאובדן חומר. אין להקפיא. תמיסה זו נשארת פעילה לפחות 6 חודשים ב 4 °C (75 °F).
- יש לדלל 100 נ"ג/מיקרוליטר של רעלן שעלת ל-3 נ"ג/מיקרוליטר באמצעות PBS. מעבירים 100 μL של רעלן השעלת המדולל למזרק הזרקת Luer-lock 1 מ"ל עם מחט 27 גרם.
3. חיסון חולדות לואיס
- ביום 0, מערבבים את התחליב כמה פעמים. יש לפזר 200 מיקרוליטר של תחליב, המכיל 1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו-200 מיקרוגרם אובאלבומין באדג'ובנט שלם של פרוינד, למזרקי Luer-lock בנפח 1 מ"ל עם מחטים של 27 גרם. הזריקו את התחליב באופן תת עורי בבסיס זנבות החולדות ללא הרדמה.
הערה: אין צורך לחמם את הזנב מראש לפני ההזרקה. כל חולדה מחוסנת ב-1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו-200 מיקרוגרם אובלבומין באדג'ובנט מלא של פרוינד עם 500 מיקרוגרם של Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- ביום ה -14, הזריקו 200 מיקרוליטר של התחליב, המכיל 1 מ"ג תמצית בלוטת הדמעות ו -200 מיקרוגרם של אובלבומין באדג'ובנט של פרוינד לא שלם, באותו אופן כמו ביום 0. הזריקו 300 ננוגרם של רעלן שעלת ב-100 מיקרוליטר של PBS תוך צפקית לכל חולדה באותו יום.
4. הזרקת תערובת האנטיגן לתת-הלחמית הקדמית ולבלוטת הדמעות כדי לגייס תאי חיסון ספציפיים לאנטיגן ולגרום לדלקת מקומית
- חשב את כמות ovalbumin ותמצית בלוטת הדמעות מבוסס על מספר החולדות בניסוי. שקול את הכמות הנדרשת של ovalbumin ולשלב אותו עם תמצית בלוטת הדמעות מופשרת מוכן בשלב 1, מה שהופך פתרון אנטיגן המכיל 1 מ"ג / מ"ל ovalbumin ו 1 מ"ג / מ"ל בלוטת הדמעות לחלץ.
- מרדימים את החולדות עם קטמין (75 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג) בהזרקה תוך צפקית. צבטו את אצבעות רגליהן של חולדות כדי להבטיח שהושגה הרדמה נאותה (כלומר, לא נצפתה תנועה מגיבה לאחר הצביטה). להזריק 5 μL של אנטיגן לתוך תת הלחמית forniceal של העין. להזריק 20 μL של אנטיגן לתוך בלוטת הדמעות.
5. הערכת תכונות העין היבשה
הערה: יש להחזיק את החולדות המורדמות בעדינות על ידי יד כפפה במצב זקוף על משטח שטוח כדי למנוע תזוזה.
- מדדו את נפח הקרע באמצעות חוט אדום פנול.
- השתמשו בזוג מלקחיים אחד כדי להחזיק את החוט ובזוג אחר כדי למשוך את העפעף התחתון של החולדה. מקם את החוט בפינה הפרוקסימלית של הפורניקס התחתון למשך דקה אחת ולאחר מכן הסר את החוט.
הערה: קרעים הופכים את החלק הרטוב של החוט בצבע אדום.
- צלם תמונה של אורך החלק הרטוב של החוט ליד סרגל עם סימונים מילימטריים. מדוד את אורך הרטיבות עד עשירית המילימטר באמצעות תוכנת תמונה (לדוגמה, ImageJ).
- מדדו את חלקות הקרנית/דמעות.
- הניחו את החולדה מתחת לסטריאומיקרוסקופ המצויד בתאורת טבעת ובמצלמה. החל 5 μL של מלוחים על הקרנית חולדה. מצמוץ פסיבי על ידי הזזת העפעפיים העליונים והתחתונים עם אצבעות הכפפות ~ 5 פעמים כדי להפיץ את המלח.
- מקדו את מאיר הטבעת במרכז משטח הקרנית תחת הגדלה של פי 1.6. קבל תמונות צילום לאחר 10 s.
הערה: מאיר הטבעות מקרין שתי שורות עגולות של תמונות נקודות על קרניות החיה. המרווח הקבוע של הנקודות הלא מעוותות מצביע על שכבת קרנית/דמעות חלקה.
