כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. זריעה של תאי הצפק בשקופיות ערוץ
- לאחר הנחת תא המקרופאג' של עכבר הצפק מעלה ומטה כדי להפחית את היווצרות הגושים, פיפטה 100 μL מתרחפת לתוך התעלה המלאה מראש (נפח, 100 μL) של שקופית תעלה מצופה פיברונקטין (לתעלה של 100 μL יש את הממדים (אורך x רוחב x גובה): 50 מ"מ x 5 מ"מ 0.4 מ"מ).
- מלאו מראש את התא על-ידי הוספת מדיום RPMI 1640 (Hepes) בתוספת 1 מ"ל לסרום לאחד משני המאגרים של מגלשת הערוץ, הטיית המגלשה ולאחר מכן שאיפת התווך מהמאגר במורד הזרם (איור 1).
- הסר בועות אוויר לא רצויות, או רצועות אוויר ארוכות, בתעלה על ידי הוספת תווך של 1-2 מ"ל לאחד משני המאגרים, יישום הדוק של מכסה המאגר, ולאחר מכן שאיבת האוויר באמצעות לחץ אגודל קצבי על הפקק, ובמידת הצורך, הטיית המגלשה. לאחר הוצאת האוויר, הטו את המגלשה עם המאגר הלא מכוסה (ומכיל מדיום) כלפי מטה לפני הסרת הפקק כדי למנוע שאיבת אוויר חזרה לערוץ.
- יש לדגור על שקופית התעלה, הזרועה בתאים, בתא לח למשך שעתיים בטמפרטורה של 37°C בהיעדרCO2 (CO2 אינו נדרש מכיוון שמערכת החיץ HCO3-/CO2 מוחלפת ב- Hepes). ניתן למקם בנוחות את שקופיות הערוץ על מדף תקשורת, המכיל שמונה שקופיות. בדרך כלל, 6-8 שקופיות מוכנות מעכבר אחד, אם כי עד 10 או יותר אפשרי.
- הסר את המדף והחלף את מדיום RPMI 1640 (Hepes) בכל שקופית בתווך RPMI 1640 המכיל ביקרבונט, בתוספת סרום בקר עוברי 10%, כמו גם פניצילין/סטרפטומיצין.
- הטו את המגלשה ושאפו תחילה מהמאגר התחתון ולאחר מכן מהמאגר העליון. לאחר מכן, הוסיפו 1 מ"ל של התווך החדש לאחד המאגרים, הטו את המגלשה, ושאפו את התווך מהמאגר במורד הזרם, לאחר שזרם בערוץ.
- לאחר שלב שטיפה זה (החלפה בינונית), מלא את שקופית הערוץ על ידי הוספת 1 מ"ל בינוני לאחד המאגרים.
הערה: שלבי שטיפה באמצעות שקופיות ערוץ הוא פשוט מאוד ויעיל במונחים של החלפת פתרונות והסרת תאים שאינם דבקים. שימו לב שמדיום RPMI 1640 (ביקרבונט) בדרך כלל מודגר מראש עם 5%CO2 למשך הלילה כדי להבטיח שיווי משקל תרמי ו-pH.
- לדגור על התאים במשך הלילה ב 37 ° C באינקובטור לח עם 5% CO2. בצע ניסויים ביום המחרת.
2. בידוד תאי דם אדומים אנושיים
- ביום השני (היום השני של הניסויים; לאחר דגירה לילית של המקרופאגים המבודדים של הצפק), לאסוף 1-2 מ"ל דם ורידי היקפי מתורם בריא, לתוך צינור heparinized. מעבירים 1 מ"ל לצינור מיקרוצנטריפוגה עגול תחתון 2.0 מ"ל (פוליפרופילן), צנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות ב 18 ° C (הגדרה אמפירית), ולהסיר את supernatant (פלזמה וציפוי באפי).
- שאפו בעדינות 100 μL של תאי הדם האדומים המשוקעים וערבבו נפח זה 1:1 עם RPMI 1640 שונה (Hepes) בינוני (מתואר להלן) בצינור מיקרוצנטריפוגה תחתון עגול של 2.0 מ"ל. תייג את הצינור "1:1".
הערה: מדיום RPMI 1640 (Hepes) המשמש ביום השני (לבדיקה) לאחר בידוד תאים מכיל, בנוסף 10% סרום בקר עוברי מומת חום, פניצילין (100 יחידות / מ"ל), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), ו 1 mM N-(2-mercaptopropionyl) גליצין (כדי להפחית phototoxicity). לאחר מכן, מדיום זה מכונה מדיום RPMI 1640 (Hepes) "שונה".
- פיפטה 4 μL של תרחיף תאי דם אדומים מדולל 1: 1 לתוך 2 מ"ל שונה RPMI 1640 (Hepes) בינוני, מראש pipeted לתוך צינור microcentrifuge 2.0 מ"ל (חזור על שלב זה, כלומר להכין 2 צינורות). תייגו כל שפופרת "4:2000". מניחים את צינורות "1:1" ו- "4:2000" על קרח.
3. תיוג קרום פלזמה מקרופאגים
- הסר את שקופיות תעלת הזרעים מאינקובטור CO2 והחלף את מדיום RPMI 1640 (ביקרבונט) בכל שקופית בתווך RPMI 1640 (Hepes) שונה. לאחר מכן, מקם את התאים בתא לח ב 37 °C בהיעדר CO2.
הערה: לאחר דגירה לילה ושטיפה, רוב הלימפוציטים מוסרים מן התעלה. רוב התאים הדבקים הנותרים הם מקרופאגים, אותם ניתן לזהות מורפולוגית או על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית באמצעות נוגדן אנטי-F4/80. כ-95% מהמקרופאגים הצפקיים החיים בעכברים הם חיוביים ל-F4/80.
- לדלל נוגדן נגד עכבר F4/80 בעל תווית ירוקה פלואורסצנטית (מאוחסן ב-4°C) 1:40 בתווך סל"ד 1640 (Hepes) שונה. קח שקופית, הטה אותה, ופיפטה (טיפה אחר טיפה) 100 μL של תערובת הנוגדנים לתוך הפתח של ערוץ 100 μL של השקף (ראה איור 1). שאפו תווך שזורם למאגר במורד הזרם. לדגור על התאים במשך 20 דקות ב 37 ° C (סביבה לחה, ללא CO2). במהלך תקופת הדגירה, סמן את תאי הדם האדומים האנושיים (ראה סעיף 5).
הערה: כפי שנרמז לעיל, CO2 אינו נדרש מכיוון שמערכת החיץ HCO3-/CO2 מוחלפת על ידי Hepes.
- לאחר זמן דגירה של 20 דקות (שבמהלכו תאי דם אדומים אנושיים מוכתמים ומאופסים), שוטפים את המגלשה על ידי הוספת 1 מ"ל מדיום RPMI 1640 שונה (Hepes) לאחד המאגרים ושאיפה של התווך לאחר שהוא זרם בערוץ, בקלות על ידי הטיית המגלשה. הוסף 1 מ"ל מדיום לאחסון לטווח קצר או המשך לניסוי (כלומר, פיפטינג בחלקיקים (תאי דם אדומים אופסוניים) והדמיית פגוציטוזה על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב בהילוך מהיר).
4. תיוג קרום הפלזמה של תאי הדם האדומים האנושיים
- התחל את התיוג של תאי דם אדומים אנושיים מיד לאחר הדגירה על שקופית של מקרופאגים עם תווית פלואורסצנטית ירוקה נוגדן אנטי F4/80 (אחרי סעיף 3.2). לאחר ערבוב עדין, קח 400 μL מאחד הצינורות "4:2000" (ראה סעיף 2.3) ושחרר אותו לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה (תחתית עגולה) 2.0 מ"ל. אפשר זמן עד שהתרחיף יתחמם לסביבות 37 מעלות צלזיוס (ראה פסקה להלן). הוסף 0.4 μL כתום / אדום פלואורסצנטי פלזמה כתם (aliquots מאוחסן ב -20 ° C), לערבב ולדגור ב 37 ° C במשך 5 דקות.
הערה: בלוק אלומיניום מחומם, הממוקם בתוך מכסה המנוע של זרימה למינרית, שימושי למזעור אובדן חום בעת הכנת שקופיות. צינורות יכולים להיות ממוקמים לתוך בארות משעמם של בלוק חימום צלחת אלומיניום נפרדת, או משולבת, מחוממת יכולה לשמש כחלל עבודה.
- לאחר תקופת הדגירה של 5 דקות, הכינו את שלב השטיפה הראשון על ידי הוספת מדיום 1600 μL שונה RPMI 1640 (Hepes) (כדי למלא את צינור המיקרוצנטריפוגה 2.0 מ"ל).
- צנטריפוגה את הצינור ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 18 ° C (הגדרה אמפירית). גלולה אדומה קומפקטית צריכה להיות גלויה על הקיר (כלומר, לא במרכז) בתחתית הצינור. סובבו את הצינור כך שהגלולה פונה כלפי מעלה והוציאו בזהירות את כל הסופרנאטנט ברצף (בשני שלבים) בעזרת קצה פיפטה בנפח 1-1.5 מ"ל.
- לאחר שאיפת הסופרנטנט, מוסיפים 2,000 μL מדיום RPMI 1640 (Hepes) שונה, מערבבים (כדי להשהות מחדש את התאים), וחוזרים על שלבי הצנטריפוגה ושאיפת הסופרנאטנט לעיל.
- להשהות מחדש את הגלולה (של קרום פלזמה מוכתם 2x שטף תאי דם אדומים) עם 400 μL של RPMI שונה 1640 (Hepes) בינוני. תייג את PMS הצינור (קיצור של כתם קרום פלזמה).
הערה: לחלופין, אסטר succinimidyl של נגזרת רודאמין רגיש pH, אשר הופך פלואורסצנטי חזק יותר ב- pH חומצי, יכול לשמש כדי לסמן תאי דם אדומים אנושיים. במקרה זה, עוצמת הפלואורסצנטיות משמשת גם כמדד להבשלת פגוזום לאחר הפנמת החלקיקים.
5. אופסוניזציה (תיוג) של תאי דם אדומים אנושיים עם עכבר אימונוגלובולין G (IgG)
- הוסף 1 μL עכבר (IgG2b) חד שבטי (משובט HIR2) נוגדן CD235a אנטי אנושי (1 מ"ג / מ"ל) (מאוחסן ב -20 ° C) לצינור שכותרתו PMS (ראה סעיפים 4.2-4.5), המכיל קרום פלזמה מוכתמים תאי דם אדומים אנושיים מרחפים בתווך 400 μL. CD235a (הידוע גם בשם גליקופורין A) הוא קרום ריאלוגליקופרוטאין ספציפי לשושלת אריתרואידית.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 8 דקות. שימו לב כי אופסוניזציה של תאי דם אדומים אנושיים עם IgG גורמת להצטברות (גושי תאים). למרות agglutination יכול לשמש אינדיקטור חזותי של opsonization, זה לא רצוי עבור הדמיה של אפקטים phagocytic יחיד. כדי לעקוף את ההצטברות, ערבבו שוב ושוב את תרחיף התא (כל דקה) באמצעות, למשל, פיפטה משתנה בנפח 20-200 מיקרוליטר המוגדרת ל-200 מיקרוליטר.
- לקראת סוף תקופת הדגירה בת 8 הדקות, אם רוצים, שטפו את שקופית המקרופאגים, מודגרת בנוגדן אנטי-F4/80 ירוק עם תווית פלואורסצנטית, עם 1 מ"ל שונה RPMI 1640 (Hepes) בינוני. ודאו ששני המאגרים של מגלשת התעלה נקיים מהמדיום לאחר שלבי השטיפה.
6. הדמיה של פגוציטוזה של קרום פלזמה מוכתמים ומצופים IgG תאי דם אדומים אנושיים
- לאחר הדגירה של 8 דקות עם נוגדן נגד CD235a (סעיף 5.2), תרחיף פיפטה 100 μL המכיל קרום פלזמה מוכתם ותאי דם אדומים אנושיים מסוג IgG לתוך ערוץ של שקופית המכילה מקרופאגים המסומנים בנוגדן פלואורסצנטי ירוק נגד F4/80 (שלב 3). לפיכך, תאי דם אדומים פלואורסצנטיים אדומים, IgG opsonized אנושי מתווספים phagocytes פלואורסצנטי ירוק (מקרופאגים).
- ברגע שנוספו תאי דם אדומים אנושיים, הרכיבו את שקופית התעלה על מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב (כאשר אינקובטור הבמה מוגדר ל -37 מעלות צלזיוס) להדמיה, למשל, באמצעות עדשה אובייקטיבית 60X/1.49 טבילת שמן. התחל הדמיה בהקדם האפשרי, שכן חלקיקים מתחילים לשקוע בתוך 1 דקות.
הערה: באמצעות חרוזים פלואורסצנטיים בקוטר של 100 ננומטר, מדדנו, על ידי ניתוח של פונקציות התפשטות נקודתית, רזולוציות XY של x = 0.22 מיקרומטר, y = 0.23 מיקרומטר (לייזר 488 ננומטר) ו- x = 0.27 מיקרומטר, y = 0.27 מיקרומטר (לייזר 561 ננומטר). עם זאת, כדי להפחית פוטו-הלבנה ופוטוטוקסיות במהלך הדמיה תלת-ממדית בהילוך מהיר של תאים חיים, אנו מתפשרים על הרזולוציה המרחבית באמצעות 2 x 2 binning. בינינג מגביר את הרגישות (משפר את יחס האות לרעש) ואת קצב הפריימים המותר, אך על חשבון הרזולוציה המרחבית.
- השתמש במערכת מיקוד מושלמת (או דומה) כדי למנוע סטיית מיקוד במהלך הקלטות. לאחר הפעלת מערכת המיקוד המושלמת, השתמש בפקד ההיסט כדי להתמקד בבלטות למליפודיאליות של מקרופאגים מיד מעל הכיסוי (ראה הערה להלן) של שקופית הערוץ. רמת מיקוד זו מתאימה ל- Z = 0 מיקרומטר. קבל ערימות Z מ- -1 מיקרומטר עד +16 מיקרומטר בשלבים של 0.8 מיקרומטר, שהם 22 פרוסות Z. ערימות Z יכולות, לדוגמה, להתקבל בקצב של 1 ערימה (לכל ערוץ) כל 15 שניות ובסך הכל 16 דקות.
הערה: תקופות הקלטה ארוכות יותר סובלות מאובדן איכות התמונה, בעיקר עקב הלבנה פוטו. ערימות Z נרכשות עבור כל אחד משני הערוצים: מקרופאגים מצולמים באמצעות לייזר 488 ננומטר (ערוץ ירוק) ותאי דם אדומים אנושיים מצולמים באמצעות לייזר 561 ננומטר (ערוץ אדום). באמצעות גישה זו, ניתן לקבל תצוגות שונות של מקרופאגים הבולעים תאי דם אדומים אנושיים מסוג IgG opsonized בנקודות זמן שונות (לדוגמה, ראו איור 2).
הערה: הגדרות אופייניות של המערכת (עם 2 x 2 binning) הן: ערוץ ירוק (20.5% לייזר (50 mW; 488 ננומטר) כוח, רגישות 101 (טווח, 0-255), וזמן חשיפה 200 ms); ערוץ אדום (עוצמת לייזר של 10.5% (50 mW; 561 ננומטר), רגישות 101 (טווח, 0-255) וזמן חשיפה של 98 אלפיות השנייה).
הערה: החלק התחתון של שקופית התעלה הוא פולימר עם אותו עובי כמו כיסוי זכוכית #1.5 ואותן תכונות אופטיות של זכוכית, אבל, יש לציין, החומר יש את היתרון של חדירות גז.
