צביעת אצטוקסימתיל Calcein להערכת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כלפי תאים סרטניים

תקציר

מקור: Chava, S. et al., Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים בדיקה למדידת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כנגד תאים סרטניים באמצעות כתם Calcein AM. המספר המופחת של תאי סרטן פלואורסצנטיים בעקבות תרבית משותפת עם תאי הרג טבעיים מצביע על ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים כלפי תאים סרטניים.

פרוטוקול

1. שיטה מיקרוסקופית מבוססת צביעת AM Calcein למדידת ציטוטוקסיות בתיווך תאי NK

1. תרבית תאי SK-HEP-1 למפגש של 70-80%. צור תרחיף חד-תאי על ידי שטיפה ראשונה של תאים עם 5 מ"ל של PBS 1x ואחריו דגירה עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA.
2. תאי צנטריפוגה SK-HEP-1 בצינור צנטריפוגה סטרילי של 1 מ"ל ב 160 x גרם למשך 3 דקות. השהה מחדש את הגלולה ב -3 מ"ל של DMEM ללא סרום.
3. הוסף 1.5 μL של תמיסת calcein AM (10 mM) לתאי SK-HEP-1 ודגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה calcein AM-labeled SK-HEP-1 תאים ב 160 x גרם במשך 3 דקות בצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל
.
4. יש לשטוף תאים פעמיים עם 5 מ"ל של 1x PBS כדי להסיר עודפי צבע calcein AM.
5. במקביל, תאי צנטריפוגה NK92MI ב 160 x גרם במשך 3 דקות בצינור צנטריפוגה סטרילית 15 מ"ל. לשטוף את גלולת התא פעם אחת עם 5 מ"ל של 1x PBS ולהשהות מחדש ב 5 מ"ל של NK92MI תווך התא.
6. ספור תאי קלצאין עם תווית AM SK-HEP-1 ותאי NK92MI באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
7. השהה מחדש תאי SK-HEP-1 בתווך התרבית ב- 1 x 10⁵ תאים/מ"ל ותאי NK92MI ב- 1 x 10⁶ תאים/מ"ל בתווך תא NK.
8. תאי SK-HEP-1 (תאי מטרה) עם תווית AM של צלחת קלצין (1 x 10,⁴/100 μL/well) עם תאי NK92MI (תאי אפקטורים) (1 x 10,⁵/100 μL/well) (יעד של 1:10: יחס אפקטור) לכל באר בבארות משולשות בצלחת של 96 בארות.
9. לדגור על לוחות 96 בארות ב 37 ° C באטמוספירה של 95% אוויר ו 5% CO₂ במשך 4 שעות. לאחר הדגירה, צלם תמונות פלואורסצנטיות של התאים המסומנים ב- calcein AM באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של פי 10. לכוד לפחות 10 שדות שונים של כל שכפול עבור כל תנאי טיפול.
10. בחר באופן אקראי 10 תמונות עבור כל שכפול וספירת תאי מטרה עם תווית חיובית ל- calcein AM, מודגרים עם או בלי תאי NK92MI. חשב % ציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה להלן.
    
    הערה: כבקרות, השתמש בתאי מטרה ללא תאי NK92MI ובתאי מטרה שעברו ליזה מלאה כבקרת ליזה מלאה. עבור ליזה מלאה, לדגור על התאים ב 0.5% Triton X-100 במשך 1 שעה (20 μL של 5% Triton X-100 ב 200 μL של מדיה תרבית).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צבע Calcein AM	סיגמא-אולדריץ'	17783
DMEM	גיבקו	11965-092
סרום בקר עוברי	גיבקו	26140079
סרום סוסים	גיבקו	16050114
תאי NK92MI	ATCC	CRL-2408
מלח חיץ פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4417
תאי SKHEP-1	ATCC	HTB-52
פתרון טריפסין EDTA	גיבקו	25200056