מדידת נדידת תאי הרג טבעיים בתגובה לגירויים כימוטקטיים

תקציר

מקור: Chava, S., et al. Measurement of Natural Killer Cell-Mediated Cytotoxicity and Migration in the Context of Hepatic Tumor Cells. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים שיטה לחקר נדידת תאי הרג טבעי (NK) דרך מערכת החדרת קרום נקבובי בתגובה לכימואטרקטנטים. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של נדידת תאי NK באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

1. בדיקת נדידת תאי NK

1. לגדל תאי NK92MI ותאי צנטריפוגות במהירות של 160 x גרם למשך 3 דקות בצינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל.
2. שטפו את גלולת התא פעמיים עם 5 מ"ל של 1x PBS והשהו מחדש את התאים ב-3 מ"ל של תווך תא NK92MI נטול סרום. ספור תאי NK92MI באמצעות המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
3. תאי צלחת NK92MI (2.5 x 10,⁵ תאים/100 מיקרוליטר/באר) בתא העליון של התא החדיר לטרנסוול (תוספת בקוטר 6.5 מ"מ וגודל נקבוביות 5 מיקרומטר).
4. בתא התחתון להוסיף 0.6 מ"ל של חומר ללא סרום המכיל חומר כדי להיבדק עבור תכונות כימואטרקנטיות של תאי NK (למשל, מדיום מותנה, chemokines, ציטוקינים).
   הערה: בעת הכנת מדיום מותנה, יש להשתמש במדיום מופחת בסרום ללא תוספת סרום כדי למנוע הפרעה מחלבוני הסרום בבדיקת הנדידה.
5. יש לדגור על 24 התאים החדירים היטב בטמפרטורה של 37°C למשך 4 שעות. לאחר 4 שעות, אספו את תאי NK92MI שאינם דבקים ונדדו מהחדר התחתון והעבירו אותם לצינורות מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) לניתוח נוסף.
   הערה: זמן התרבית עשוי להשתנות בהתאם לסוג תאי המטרה, כמו גם לכמות ולקינטיקה של כימוקינים המיוצרים על ידי תאי היעד. לכן, זמן זה צריך להיקבע אמפירית עבור כל סוג תא, כימוקין, וניסוי.
6. הוסף מספר קבוע מראש של חרוזי ספירה עבור ציטומטריית זרימה בנפח של 50 μL לכל צינור המכיל תאי NK נודדים. הערך את הנפח של תרחיף תאים 300 μL/well באמצעות כל ציטומטר זרימה המסוגל לספור תאים אוטומטי מבוסס FACS.
   הערה: ערבבו או ערבבו את חרוזי הספירה עבור ציטומטריית זרימה ביסודיות בכל פעם לפני השימוש כדי להבטיח שמספר קבוע של חרוזים ישמש למזעור השונות הניסיונית. מומלץ לבצע פיפטינג הפוך עם חרוזי ספירה כדי לשמור על דיוק. השתמש רק בתאי NK וספירת חרוזים עבור ציטומטריית זרימה כפקדי ניתוח FACS. המחברים ממליצים לקרוא לפחות 10,000 חרוזים + תאי NK ביחד, כמות שעבדה היטב. עם זאת, מספר זה עשוי להשתנות בהתאם לתנאי הניסוי. לכן, יש לקבוע אמפירית את המספר המשולב של חרוזים + תאי NK עבור כל סוג של ניסוי. בנוסף, חשוב לבצע ניסויים באמצעות טריפליקטים ביולוגיים כדי להשיג תוצאות מובהקות סטטיסטית ולהסביר את השונות בין ספירות תאים שונות.
7. חשב את המספר המוחלט של תאי NK92MI שהועברו באמצעות נוסחה זו:
   
   כאשר A = מספר תאים, B = מספר החרוזים, C = ספירת חרוזים מוקצים של הלוט (מספר חרוזי ספירה עבור ציטומטריית זרימה/50 μL; בדוגמה זו 49,500), ו- D = נפח הדגימה (μL).
   הערה: אם 300 μL של נפח דגימה (תאים מועברים) משמש לניתוח FACS עם 50 μL של ספירת חרוזים עבור ציטומטריית זרימה, המספר המוחלט של תאים שהועברו = 1,700 תאים /3,300 אירועי חרוזים x 49,500 חרוזים / 300 μL = 84.975 תאים/μL. יש לתקן את החישוב אם הדגימה מדוללת או אם נעשה שימוש בנפח אחר של חרוזי ספירת FACS.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ספירה מוחלטת של חרוזים	תרמו פישר סיינטיפיק	C36950
תאי NK92MI	ATCC	CRL-2408
תאי SKHEP-1	ATCC	HTB-52
תאים חדירים לשקוף	כוכב משנה	3241
Opti-MEM	גיבקו	31985070
מלח חיץ פוספט (PBS)	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 4417
אלפא-מם	סיגמא-אולדריץ'	M4256