$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכינו חיידקים משלימים ומכוונים
- הכינו משלים ארנב תינוק (BRC)
הערה: קריטריונים מפורטים לבחירת מגרש משלים ניתן למצוא כאן: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- להשיג BRC קפוא ולהפשיר עם מים קרים זורמים. מערבבים פיזית את BRC כל ~ 10-20 דקות עד להפשרה מלאה. אין לחשוף את BRC למחזורי הקפאה-הפשרה חוזרים ונשנים.
- בזמן ש-BRC מפשיר, יש לסמן צינורות צנטריפוגות בנפח 1.5 מ"ל, 5 מ"ל או 15 מ"ל. הניחו את הצינורות המסומנים על קרח לקירור מוקדם. Aliquot נפח תקין BRC צינורות צנטריפוגות מקורר מראש (לאחר מילוי, מיד להחזיר כל צינור לקרח). לאחסן aliquots ב ≤ -70 °C במקפיא.
הערה: כ 1 מ"ל של השלמה נדרשת עבור כל צלחת בדיקה. aliquots משלימים הם לשימוש יחיד ויש aliquoted בכרכים המתאימים לפריסות הערכה.
- כדי להכין BRC מומת חום, הפשיר aliquot אחד של BRC פעיל. הכינו אמבט מים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרת BRC לחלוטין, מעבירים אותו לאמבט המים ודגרים למשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה, יש להסיר BRC מומת חום מאמבט המים ולאפשר לו להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10-15 דקות. מערבבים במרץ, ו aliquot ~ 150 μL עד 1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה. לאחסן aliquots ב ≤ -10 °C.
- הכינו מלאי חיידקי מטרה
הערה: ההליך להלן משמש להכנת 48 aliquots של מלאי חיידקי מטרה; אם יש צורך ב- Aliquots נוספים, ניתן להרחיב את הפרוטוקול.
- הוציאו את בקבוקון החיידקים מהמקפיא וגרדו את משטח החיידקים הקפואים כדי להסיר כמות קטנה של קרח מהבקבוקון אל צלחת אגר דם. מיד להחזיר את בקבוקון המניות הראשי למקפיא.
- פזרו את האליקוט הקטן הזה של מלאי חיידקים על צלחת אגר הדם וכסו אותו במכסה הצלחת. דוגרים על הצלחת הפוך למשך הלילה באינקובטור CO2 של 37°C/5%.
- העבר ~ 10 מושבות חלקות מבודדות לצינור 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל מרק LB. יש לדגור במשך 3-5 שעות בטמפרטורה של 37°C עם ניעור עדין עד שלציר התרבית יש OD600 של ~0.6-0.7.
- קצרו את 12.5 מ"ל העליון של התרבית והעבירו לצינור טרי של 50 מ"ל. צנטריפוגה את התרבית ב 15,000 x גרם במשך 2 דקות באמצעות מיקרו צנטריפוגה שולחן. יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-25 מ"ל של 15% גליצרול-LB סטרילי.
- מערבבים היטב ומחלקים 0.5 מ"ל aliquots לתוך סטרילי 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge (~ 48 צינורות). יש לאחסן aliquots ב ≤ -70 °C במקפיא.
- יש לאשר את זהות החיידק באמצעות בדיקת האגלוטינציה לפני השימוש.
- קביעת גורם דילול אופטימלי למלאי חיידקי המטרה
הערה: כל אצווה של מלאי חיידקי מטרה חייבת לעבור טיטרציה בתנאי בדיקה כדי לקבוע את הדילול הדרוש כדי להניב ~120 CFU/נקודה על לוחות LB.
- קבל צלחת microtiter (צלחת דילול) ולהוסיף 135 μL של חיץ Assay לבאר 1A. להוסיף 120 μL של חמאת Assay בארות 1B-1H.
- מוציאים בקבוקון של חיידקי מטרה קפואים מהמקפיא ומפשירים בטמפרטורת החדר. הוסף 15ul של מלאי חיידקים מופשר לבאר 1A כדי לבצע דילול פי 10 של מלאי החיידקים.
- העבירו 30 מיקרוליטר של תמיסה חיידקית מבאר 1A לבאר 1B כדי לבצע דילול טורי פי 5. המשך דילול סדרתי פי 5 לבאר 1H ובסך הכל 8 דילולים (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- קבל צלחת מיקרוטיטר נוספת (Assay Plate) והוסף 20 μL של חיץ Assay לכל הבארות בעמודות 1 ו -2 בצלחת Assay.
- מעבירים 10 μL של חיידקים מדוללים מכל באר בעמודה 1 של צלחת הדילול לבארות המתאימות בעמודות 1 ו-2 של צלחת הבדיקה. 10 μL של חיידקים מועבר מבאר 1A של צלחת הדילול לבאר 1A ו-2A בצלחת Assay וכו'.
- המשך עם הבדיקה כמתואר בבדיקת החיידקים בסרום (SBA) להלן עבור בקרה A ובקרה B, שלבים 3.6-3.12.
- לאחר שהלוחות הודגרו על קרח, השתמשו בפיפטה רב-ערוצית עם 8 קצוות פיפטה כדי לזהות 10 μL מהבארות בטור 1 על צלחת LBA. כמו כן, אתר את הבארות מטור 2 אל לוח LBA.
- המשך עם הבדיקה כמתואר להלן בשלבים 3.14-4.6.
- קבע את דילול החיידקים שמניב ~ 120 CFU/נקודה בבקרה B, דילול זה ישמש בבדיקה.
2. בדיקת חיידקים בסרום (SBA)
הערה: ההליך המתואר להלן הוא עבור צלחת בדיקה אחת, אך ניתן להגדיל את מספר לוחיות הבדיקה.
- דגימות בדיקה מנוטרלות חום על ידי דגירה באמבט מים של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: דגימות הבדיקה חייבות להיות מנוטרלות בחום לפני הבדיקה כדי לבטל כל פעילות משלימה אנדוגנית. ניתן לעשות זאת לפני הבדיקה וניתן להקפיא מחדש דגימות לא פעילות או לאחסן ב -4 מעלות צלזיוס עד לבדיקה.
- קבל צלחת Assay והוסף 20 μL של מאגר Assay לעמודות 1 עד 12 של שורות A עד G. הוסף 20 μL של מאגר Assay לעמודות 1 ו- 2 של שורה H, ראה טבלה 1.
- טען 30 μL של כל דגימת בדיקה, בכפול, לשורה H של צלחת הבדיקה. לדוגמה, לחלק 30 μL של מדגם 1 לתוך בארות 3H ו 4H, ולחלק 30 μL של מדגם 2 לתוך בארות 5H ו 6H, וכו '
- בצע דילול סדרתי פי 3 של דגימות בדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- הסר 10 μ מהדגימה מבארות 3H-12H והעבר אותה לבארות המתאימות בשורה G וערבב היטב את הדגימה על ידי צנרת למעלה ולמטה 8-10 פעמים.
- לאחר מכן להסיר 10 μ מבארות 3G-12G ולהעביר בארות המתאימות בשורה F ולערבב היטב.
- המשך את הדילולים הסדרתיים הללו דרך שורה A. לאחר ערבוב הבארות בשורה A, יש להסיר ולהשליך 10 μl מבארות 3A-12A כך שכל הבארות יכילו 20 μl.
הערה: מכיוון ש- 20 μL של סרום משמש בנפח בדיקה כולל של 80 μL, יש דילול נוסף פי 4 בבדיקה. דילול זה חייב להילקח בחשבון במהלך החישוב של טיטר SBA על ידי הכפלת דילול הסרום ב -4. לדוגמה, אם משתמשים בדילול התחלתי של 1:2, הדילול בפועל הנבדק הוא 1:8.
- יש להסיר בקבוקון אחד של מלאי חיידקי מטרה קפואים ולהפשיר בטמפרטורת החדר. לדלל את החיידקים ב 20 מ"ל של חיץ Assay על פי גורם הדילול האופטימלי שנקבע מראש (גורם דילול זה נקבע בסעיף 1.3). הוסף 10 μL של חיידקים מדוללים לכל באר של צלחת הבדיקה באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- הסר בקבוקון אחד של BRC קפוא ובקבוקון אחד של BRC קפוא מומת חום, הפשיר בטמפרטורת החדר עם מים קרים זורמים, או הנח על הסורג של ארון בטיחות ביולוגי עם אוויר נושף כדי להפשיר במהירות.
- הכינו תמיסה של 20% BRC מומת חום. יש לערבב 100 μL של BRC מנוטרל חום עם 400 μL של מאגר Assay. הוסף 50 μL של תמיסת BRC 20% מומתת חום זו לכל הבארות בעמודה 1 (בארות Control A).
הערה: BRC מומת חום משמש כבקרה לניטור הרג לא ספציפי (NSK) בבדיקה.
- הכינו פתרון של 20% של BRC מקורי. מערבבים 1 מ"ל של BRC מקורי עם 4 מ"ל של מאגר Assay. הוסף 50 μL של תערובת זו לכל הבארות בעמודות 2 עד 12 (Control B ו- test sample wells).
הערה: הריכוז הסופי של BRC בתערובת התגובה הוא 12.5%.
- ערבבו בקצרה את צלחת Assay על ידי ניעור עדין במשך 10-15 שניות על שייקר צלחת או ערבבו על ידי פיפט למעלה ולמטה 8 פעמים באמצעות פיפטה רב ערוצית.
- שים את צלחת הבדיקה באינקובטור מיקרוביולוגי של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים (ללא טלטול).
- יבשו 2 צלחות LBA על ידי הסרת מכסים והנחת צלחות עם הפנים כלפי מעלה בארון הבטיחות הביולוגי למשך 40-60 דקות.
- כאשר הדגירה של שעתיים הושלמה, הזיזו את צלחת Assay לקרח רטוב ודגרו במשך 10-20 דקות כדי לעצור את התגובה.
- בעזרת פיפטה בת 12 ערוצים, מערבבים את הבארות בשורה H, וממקמים צלחת 10 μL של תערובת התגובה על תחתית צלחת LBA. מיד להטות את הצלחת ולאפשר כתמים לרוץ במשך ~ 1.5-2 ס"מ. חזור על הליך זה עבור שורות G, F ו- E, ואתר אותן מעל השורה הקודמת בלוח LBA. שורות E, F, G ו-H מנוקדות על לוח LBA אחד, ושורות A, B, C ו-D מנוקדות על לוח LBA שני באותו אופן, ראו איור 1.
- דוגרים על צלחות ה-LBA בטמפרטורת החדר עד שהתמיסה נספגת בצלחות ה-LBA (10-15 דקות). הניחו את המכסים על לוחות ה-LBA והניחו את לוחות ה-LBA באינקובטור המיקרוביולוגי הפוך כדי לדגור למשך הלילה (~16-18 שעות). לדגור Shigella flexneri 2a ו 3a ב 29 ° C ולדגור S. sonnei הוא ב 26 ° C.
הערה: טמפרטורות אלה מניבות "מיקרו-מושבות" קטנות יותר עם גדלים המתאימים לספירה מדויקת על ידי מונה מושבה9.
- לאחר הדגירה של הלילה, יש להוסיף 25 מ"ל של אגר שכבת-על (ב~55°C) המכיל 100 מיקרוגרם/מ"ל TTC ו-0.1% NaN3 לכל צלחת LBA.
- דגרו על לוחות LBA בטמפרטורה של 37°C במשך שעתיים כדי לאפשר לחיידקים ששרדו לפתח צבע אדום, ראו איור 1 להלן.
- לוחות צילום באמצעות מצלמה דיגיטלית והעברת תמונות למחשב שבו הותקנה תוכנת ספירת המושבה המשולבת של NIST (NICE), ראה איור 2.
הערה: תוכנת ספירת המושבה של נייס זמינה ללא תשלום. עיין ברשימת החומרים לקבלת פרטים והוראות התקנה.
טבלה 1: פריסת לוח Assay. עמודות 1 ו-2 מכילות את בארות הבקרה המשלימות (complement control wells). בקרה A ממוקמת בעמודה 1 והיא בקרת המשלים הבלתי פעילה בחום, המכילה חיץ SBA, חיידקים ומשלים מומתים בחום. בקרה B ממוקמת בעמודה 2 והיא בקרת המשלים הפעילה, המכילה מאגר SBA, חיידקים ומשלימים. עמודות 3-12 מכילות דגימות סרום. כל דגימה מופעלת בשכפול ובדילול סדרתי פי 3 משורה H לשורה A
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| א | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 | דילול 8 |
| ב | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 | דילול 7 |
| ג | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 | דילול 6 |
| ד | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 | דילול 5 |
| ה | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 | דילול 4 |
| ו | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 | דילול 3 |
| ז | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 | דילול 2 |
| ח | שליטה א' | בקרה ב' | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 | דילול 1 |
| | | Sample 1 | Sample 2 | Sample 3 | Sample 4 | Sample 5 |
