ניתוח של efferocytosis של thymocytes אפופטוטי על ידי מקרופאגים פריטוניאליים

תקציר

מקור: Zhen, Y. et al., Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים הליך לניתוח אפרוציטוזה בתיווך מקרופאגים פריטוניאליים של תימוציטים של עכבר אפופטוטי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

פרוטוקול

כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.

1. הכנת תימוציטים אפופטוטיים עם תווית CFSE

1. יש להרדים שני עכברים תמימים מסוג C57/B6 על ידי שאיפת_CO2 למשך 10 דקות ולנתח כדי לפתוח את חלל בית החזה, להוציא (לשלוף) את בלוטת התימוס עם מלקחיים מעוקלים בעלי קצה דק לתוך צלחת פטרי תרבית רקמה המכילה 10 מ"ל של מדיום RPMI1640.
2. השג תרחיף חד-תאי על-ידי טחינת בלוטת התימוס כולה כנגד שני קצוות חלביים של שקופיות המיקרוסקופ ולאחר מכן סנן את התרחיף דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר.
3. אספו את מתלה בלוטת התימוס בנפח 10 מ"ל לתוך צינור של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 300 x גרם למשך 5 דקות.
4. הסר את supernatant, resuspend ב 40 מ"ל של 1x PBS, ולספור מספרי תאים עם hemocytometer.
5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
6. השהיה מחדש ב 20 מ"ל של 1x PBS בצינור 50 מ"ל כתרחיף תא יחיד עם עד 2 x 10⁸ תאים (אם יותר מ 2 x 10⁸ תאים, להשעות מחדש את שאר התאים עוד 20 מ"ל של 1 x PBS בצינור אחר 50 מ"ל).
7. הפוך 5 מיקרומטר של CFSE בנפח שווה (20 מ"ל) של 1x PBS בצינור נפרד של 50 מ"ל על ידי פיפטציה של 40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי CFSE (2.5 מ"ל) לתוך 20 מ"ל של 1x PBS וערבב היטב על ידי היפוך הצינור 2 - 3 פעמים.
8. הוסף את 20 מ"ל CFSE משלב 1.7 לתוך 20 מ"ל של תרחיף תאים משלב 1.6 (הריכוז הסופי של CFSE הוא כעת 2.5 מיקרומטר).
   הערה: עבור כל השעיית תאים של 20 מ"ל, יש צורך בצינור CFSE של 20 מ"ל.
9. הפוך את התא ואת צינור תערובת CFSE 2 - 3 פעמים ודגור על התערובת בחושך בטמפרטורת החדר למשך מקסימום של 2 דקות, ולאחר מכן עצור את התגובה על ידי הוספת 10 מ"ל של נסיוב סוס מומת חום.
10. צנטריפוגה את תערובת הצינור 50 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: אם תיוג CFSE מצליח, גלולת התא תהפוך לצהובה בהירה.
11. הסר את supernatant ו resuspend את גלולת התא ב 40 מ"ל של 1x PBS ולספור מספרי תאים עם המוציטומטר.
12. צנטריפוגה את מתלה התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות ולזרוק את supernatant.
13. לשטוף את גלולת התא שוב עם 40 מ"ל של RPMI1640 בינוני.
14. הסר את הסופרנאטנט והשהה מחדש תאים עם מדיום תרבית רקמה RPMI1640 (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (מנוטרל חום), 20 mM גלוטמין ו- 1x Pen/Strep) בריכוז של 7 x 10⁶ תאים/מ"ל בצלחת תרבית רקמה 100 מ"מ.
    הערה: אם יתקבלו תאים נוספים, יהיה צורך בצלחת תרבית רקמה נפרדת של 100 מ"מ.
15. הוסף staurosporine לתוך תרבית תרחיף התא בריכוז סופי של 1 μM ותרבית במשך 4 שעות ב 37 ° C באינקובטור תרבית רקמה מסופק עם 5% CO_2.

2. הכנת מקרופאגים פריטוניאליים

1. הזריקו שני עכברי C57B6 (או כל עכבר שעבר מניפולציה גנטית במעבדה) תוך צפקית עם 1 מ"ל של 3% תיוגליקולאט בגיל 3% ביום 0.
2. הרדימו את העכברים ביום 5 כמו בשלב 1.1, חתכו וקילפו את עור הבטן אך השאירו את הצפק שלם. שטפו את חלל הצפק על ידי דחיפה מהירה של 10 מ"ל של חיץ שטיפה (RPMI1640, 2% FBS, 0.04% EDTA) לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 10 מ"ל המחובר למחט 18 גרם.
3. אחזרו את חיץ הכביסה באיטיות עם אותה מחט/מזרק ואספו את חיץ הכביסה לתוך צינור של 50 מ"ל.
4. לשטוף את gavage הצפק פעמיים עם 1x PBS, להשעות מחדש את המקרופאגים הצפק בתווך תרבית רקמה RPMI1640 בצפיפות של 2 x 10⁶ תאים / מ"ל ו aliquot 500 μL לתוך כל באר של צלחת 24 באר. השאירו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות למשך שעתיים.
5. הסר את התאים הצפים על ידי שאיפה והחלפתם עם 500 μL של מדיום תרבית טרי, פעמיים.
6. לחלופין, הוסיפו מעכב טירוזין לקולטן TAM, RXDX-106, בריכוזים המצוינים באגדות האיור לכל באר של תרבית המקרופאגים ודגרו במשך שעתיים נוספות.

3. תרבית משותפת של מקרופאגים פריטוניאליים עם תימוציטים אפופטוטיים

1. אספו תימוציטים אפופטוטיים משלב 1 ושטפו שלוש פעמים עם מדיום RPMI1640. את יעילות האינדוקציה האפופטוטית ניתן למדוד בשלב זה באמצעות ערכת Annexin V/7-AAD.
2. פזרו 0 - 12 x 10⁶ תאים (בתווך 500 μL) לכל באר של תרביות המקרופאגים מפרוטוקול #2, בהתאם לסידור הניסוי (למשל, ראו איור 1). זה עושה את כל נפח התרבות של 1 מ"ל בכל באר של צלחת 24 באר. הוסף את הנוגדן החוסם לתרבית מיד לפני הוספת תימוציטים אפופטוטיים.
3. תרבית את תערובת התאים ב 37 ° C במשך 4 שעות באינקובטור תרבית רקמות מסופק עם 5% CO₂.
4. שטפו כל באר של התרבית עם 1x PBS (המכיל 500 מיקרומטר EDTA) פעמיים כדי להסיר את התאים האפופטוטיים הצפים בחופשיות.
5. הכתימו את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם CD11b-PE בשלב זה.
   1. שטפו את המקרופאגים הקשורים לצלחת עם חיץ מכתים (1x PBS, 1% BSA) פעם אחת.
   2. הוסף 200 μL של חיץ צביעה המכיל 2 μL CD11b-PE לכל באר.
   3. לדגור על הצלחת ב 4 ° C במשך 20 דקות.
   4. שטפו כל באר של הצלחת שלוש פעמים עם חיץ הצביעה.
   5. הוסף 200 μL של חיץ צביעה והמשך עם הצלחת לניתוח תמונה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

תוצאות

איור 1. אחוז phagocytosis של thymocytes אפופטוטי על ידי מקרופאגים פריטוניאליים. תימוציטים אפופטוטיים הושרו על ידי דגירה עם 1 מיקרומטר של staurosporine במשך 4 שעות ונוספו לתרבית מקרופאגים ביחס כפי שמצוין בלוחות האיור: (A) 1:0; (ב) 1:1; (ג) 1:2; (ד) א' 4; (ה) 1:6; (ו) א' 8; (ז) 1:10; (ח) 1:12. הנתונים נרכשו באמצעות ציטומטר זרימה. אחוז המקרופאגים הפאגוציטיים נותח באמצעות התוכנה המשויכת ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חיץ שוכב Ack	גיבקו	A10492
נספח V/7-AAD	BD Pharmingen	559763
נוגדן אנטי-מר	מערכות מו"פ	BAF591
CD11b-PE (שיבוט M1/70)	BD Pharmingen	553311
CFSE	Invitrogen	C1157
DMSO	סיגמא-אולדריץ'	D-2650
EDTA (0.5 מילימול)	גיבקו	15575-020
צינורות FACS	BD Biosciences	352017
סרום סוסים (מנוטרל חום)	Invitrogen	26050088
PBS, 1x	קורנינג	21040CV
RPMI-1640	קורנינג	10040CV
RXDX-106	סלק כימיקלים	CEP-40783
סטאורוספרין (100 מ"ג)	פישר סיינטיפיק	BP2541-100	הוסף 214.3 מ"ל של DMSO לתוך 100mg כדי ליצור פתרון גרב 1mM