$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. קיטוב HMDM
- בתנאים סטריליים, הכינו את מדיית הפריימינג M1 על ידי הוספת אינטרפרון γ (IFNγ; 20 ננוגרם/מ"ל) וליפופוליסכריד (LPS; 1 מיקרוגרם/מ"ל) למדיית התרבית המלאה של RPMI-1640. הכן את מדיית הפריימינג M2 על-ידי הוספת אינטרלוקין 4 (IL-4; 20 ננוגרם/מ"ל) למדיית התרבות המלאה של RPMI-1640.
- בתנאים סטריליים, יש לשאוב מדיה מבארות לוחות תרבית הרקמה המכילות את המקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים, HMDM, שנזרעו ותורבתו כמתואר בסעיף 1.
- בזהירות לשטוף את הבארות המכילות את התאים 3x עם PBS סטרילי (מחומם מראש ל 37 ° C), באמצעות 1 מ"ל aliquots של PBS.
- הוסף 1 מ"ל של מדיית ההכנה M1 או M2 לכל באר המכילה את HMDM (המתאים לניסוי).
- לדגור על התאים במשך 48 שעות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 באינקובטור התא.
2. גירוי של HMDM כדי לגרום לשחרור MET
- בתנאים סטריליים, הכינו את מצע התרבית המכיל ממריצים שונים של מלכודות מקרופאגים חוץ-תאיות שחרור MET (לפי המתאים לניסוי) למדיית RPMI-1640 המלאה: PMA (25 ננומטר), TNFα רקומביננטי אנושי (25 ננוגרם/מ"ל), או IL-8 רקומביננטי אנושי (50 ננוגרם/מ"ל).
- לניסויים עם חומצה היפוכלורית, גירוי HOCl, הכינו HOCl (200 מיקרומטר) ב-HBSS (שחומם מראש ל-37°C), מיד לפני התוספת לתאים. ודא כי HOCl אינו מוכן מדיה סלולרית מלאה.
הערה: ריכוז תמיסת המלאי של HOCl מכומת על ידי מדידת ספיגת UV של התמיסה ב 292 ננומטר ו- pH = 116 ובאמצעות מקדם הכחדה של 350 M-1 cm-1.
- לאחר טיפול הקיטוב המתואר בסעיף 2, שאפו את המדיה התאית מכל באר ושטפו בזהירות את התאים 3x עם 1 מ"ל aliquots של אחד מהם: PBS סטרילי (עבור PMA, TNFα ו- IL-8) או HBSS (עבור HOCl), אשר התחממו מראש ל 37 מעלות צלזיוס.
- לניסויים עם PMA, TNFα או IL-8: יש להוסיף 1 מ"ל של המדיה המלאה המכילה PMA, TNFα או IL-8 לאחר הסרת PBS בשלב הכביסה הסופי.
- עבור ניסויים עם TNFα, לדגור על התאים במשך 6 שעות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 באינקובטור התא. עבור ניסויים עם PMA ו- IL-8, לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 באינקובטור התא.
- לניסויים עם HOCl, יש להוסיף 1 מ"ל HOCl ב-HBSS לאחר הסרת ה-HBSS בשלב הכביסה הסופי. לאחר מכן, לדגור על התאים במשך 15 דקות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 באינקובטור התא.
- בזהירות לשאוף את התא supernatant ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל aliquots של HBSS כמתואר בשלב 2.3.
- לאחר הסרת HBSS משלב השטיפה הסופי, הוסף 1 מ"ל של מדיית תרבות RPMI-1640 מלאה. לאחר מכן, לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C בנוכחות 5% CO2 באינקובטור התא.
3. הדמיה של MET בתרבית תאים חיים
- הכינו צבע ירוק SYTOX ב-HBSS בריכוז של 40 מיקרומטר.
- בסוף הטיפולים המתוארים בסעיף 2 כדי לגרום לשחרור MET, יש להוסיף ישירות 25 μL של 40 מיקרומטר של הצבע לכל באר המכילה HMDM.
- יש לדגור על תאים בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות בחושך.
- מקם את ה-HMDM בבארות תרבית רקמה על במת המיקרוסקופ של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך לצורך הדמיה.
- נהלי מיקרוסקופ
- הפעל מקור אור פלואורסצנטי בעל ספקטרום רחב, מקור אור שדה בהיר ומיקרוסקופ הפוך המותקן עם מצלמה דיגיטלית צבעונית ברזולוציה גבוהה (ראה טבלת חומרים).
- סובב את גלגל המסנן למצב "מספר 2" עבור פלואורסצנטיות ירוקה (עירור = 504 ננומטר, פליטה = 523 ננומטר) לצורך הדמיה של הדגימות המוכתמות הירוקות הכלולות בבארות תרבית הרקמה.
- באמצעות המטרה 5x, מקדו את התמונה עם המיקוד הגס, ולאחר מכן ידיות המיקוד העדינות במיקרוסקופ, עד שהתמונה נראית חדה, ברורה וממוקדת כאשר מסתכלים דרך עינית המיקרוסקופ.
- העבר את המיקרוסקופ למצב מצלמה.
- הפעל את התוכנה המשויכת.
- בחר את לכידת הכרטיסייה בתוכנה.
- לחץ על הלחצן Play כדי להציג תצוגה מקדימה של התמונה ולהתאים את ידית המיקוד העדינה במיקרוסקופ עד שהתמונה תיראה חדה, ברורה וממוקדת בחלון התצוגה המקדימה של התוכנה.
- לחץ על הלחצן לכידה.
הערה: התמונה שצולמה תוצג באופן אוטומטי בתוכנה הנלווית.
- בתוך התוכנה, לחץ על קובץ | שמור כסוג קובץ התמונה הנדרש.
- במיקרוסקופ, סובב את גלגל המסנן למצב "מספר 5" להדמיית שדה בהיר וחזור על שלבים 3.5.2-3.5.9 כדי לקבל את תמונת שדה הבהירות המתאימה.
- חזור על השלבים 3.5.2-3.5.10 לפי הצורך לרכישת תמונה לאחר מכן.