כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.
1. טיהור לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים אנושיים ובידוד של סרום אנושי
הערה: יש לבדוק באופן שגרתי את נוכחות האנדוטוקסין של כל הריאגנטים באמצעות ערכה מסחרית לזיהוי אנדוטוקסין, ועליהם להכיל אנדוטוקסין <25.0 pg/mL כדי למנוע פרימה לא רצויה של PMNs.
- הביאו 50 מ"ל של 3% דקסטרן-0.9% NaCl (w/v), 35 מ"ל של 0.9% NaCl (w/v), 20 מ"ל של 1.8% NaCl (w/v), 12 מ"ל של 1.077 גרם/מ"ל תמיסת שיפוע צפיפות ו-20 מ"ל מים ברמת הזרקה או השקיה לטמפרטורת החדר.
- כדי לבודד סרום אנושי, לדגור 4 מ"ל של דם אנושי טרי ללא נוגדי קרישה ב 37 ° C בצינור זכוכית 15 מ"ל במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב 2,000-3,000 × גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את שכבת הסרום העליונה לצינור צנטריפוגה חרוטי טרי בנפח 15 מ"ל ומניחים אותו על קרח.
- יש לשלב 25 מ"ל של דם אנושי שלם שעבר הפרין טרי (1,000 יחידות למ"ל) עם 25 מ"ל בטמפרטורת החדר, 3% דקסטרן-0.9% NaCl (יחס של 1:1) בשני צינורות צנטריפוגות חרוטיות משוכפלות של 50 מ"ל (נפח כולל של 50 מ"ל לכל צינור). ערבבו על ידי נדנוד עדין של כל צינור חרוטי בנפח 50 מ"ל ולאחר מכן הניחו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- לאחר הדגירה בטמפרטורת החדר יופיעו שתי שכבות נפרדות. העבירו את השכבה העליונה של כל תערובת דם דקסטרן לתוך צינורות חרוטיים חדשים של 50 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 450 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם בלמים נמוכים או ללא בלמים.
- שאפו בזהירות את שני הסופרנאטנטים והשליכו אותם מבלי להפריע לכדורי התא. השהה מחדש בעדינות כל כדור תא ב -2 מ"ל של טמפרטורת החדר 0.9% NaCl, שלב את הכדוריות המרחפות מחדש בצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל, ולאחר מכן הוסף את 0.9% NaCl הנותרים (נפח סופי של 35 מ"ל).
- יש להניח בזהירות 10 מ"ל בטמפרטורת החדר של 1.077 גרם/מ"ל תמיסת שיפוע צפיפות מתחת לתרחיף התא באמצעות פיפטה ידנית. סחרור במהירות של 450 x גרם במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם בלמים נמוכים או ללא בלמים. שאפו בעדינות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. הסופרנאטנט יכיל תאי דם חד-גרעיניים היקפיים שניתן לאסוף כפי שתואר קודם לכן.
- לשעו את תאי הדם האדומים על ידי השעיית גלולת התא ב -20 מ"ל מים בטמפרטורת החדר. מערבבים בעדינות על ידי נדנוד הצינור למשך 30 שניות. הליזה של תאי הדם האדומים תלווה בירידה מובהקת בעכירות.
- הוסף מיד 20 מ"ל של 1.8% NaCl (בטמפרטורת החדר [RT]) ודגימת צנטריפוגות ב 450 × גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: חשוב למזער את הזמן שבו PMN נשארים במים לבד לאחר ליזה של תאי דם אדומים כדי למקסם את תפוקת PMN ולמנוע ליזה ו / או הפעלה של PMN.
- שאפו בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא. השהה מחדש בעדינות את גלולת התא ב 2 מ"ל של RT RPMI 1640 בינוני ומניחים אותו על קרח.
- ספירת תאים באמצעות המוציטומטר. השהה מחדש PMN מטוהרים בריכוז של 1 x 107 תאים/מ"ל בסל"ד קר כקרח ושמור אותם על קרח.
- שלב 100 μL של PMN מטוהרים (1 x 106 תאים) עם 300 μL של מלח חוצץ פוספט (DPBS) קר כקרח של Dulbecco המכיל 1 μL של כתם יודיד פרופידיום בשני צינורות ציטומטריה זרימה משוכפלת. לבקרה חיובית על נזק לקרום הפלזמה, הוסף 40 μL של תמיסת טריטון X-100 0.5% לאחד מצינורות ציטומטריית הזרימה וערבב היטב.
- השתמשו בציטומטריית זרימה כדי למדוד את הפיזור הקדמי, הפיזור הצידי והצביעה של פרופידיום יודיד (עירור/פליטה מקסימליים ב-535/617 ננומטר) של תאים מטוהרים (איור 1).
הערה: ניתוח פיזור קדימה וצדדית יזהה אוכלוסיות לא רצויות של לימפוציטים ומונוציטים. פרופידיום יודיד יכתים רק תאים עם קרום פלזמה פגום ואין להשתמש ב- PMN מטוהרים שיש להם אוכלוסיות בולטות של תאים חיוביים ליודיד פרופידיום. עבור מחקרים אלה, PMN מטוהרים שימשו רק אם הם היוו >98% של תאים מטוהרים ו -<5% מוכתמים חיוביים עבור יודיד פרופידיום.
- הכינו צלחת של 96 בארות למבחני ציטוטוקסיות PMN על ידי ציפוי בארות בודדות שישמשו בבדיקה זו עם 100 μL של 20% סרום אנושי מבודד שנמהל ב- DPBS.
הערה: ציפוי PMN ישירות על פלסטיק או זכוכית יגרום להפעלה של התאים. הקפד לכלול לפחות באר בקרה שלילית אחת שתקבל רק מדיה ולפחות באר בקרה חיובית אחת שתקבל 0.05% Triton X-100.
- לדגור על הצלחת ב 37 ° C במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, שטפו את הבארות המצופות פעמיים עם DPBS קר כקרח כדי להסיר עודפי סרום. טפחו בעדינות על הצלחת הפוכה כדי להסיר שאריות DPBS והניחו אותה על קרח.
- הוסף בעדינות 100 μL של PMN אנושי מטוהר ב 1 x 107 תאים / מ"ל לכל באר מצופה (1 x 106 PMN / באר). אפשרו ל-PMN להתיישב בבארות על ידי דגירה על הצלחת על קרח למשך 5 דקות לפחות. שמור על רמת הצלחת כדי לאפשר פיזור אחיד של תאים בכל באר והשאר אותה על קרח כדי למנוע הפעלה לא רצויה של PMNs.
2. בדיקת ציטוטוקסיות של חלבונים חוץ-תאיים מסוג S. aureus כנגד לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים אנושיים
- תרבית S. aureus לילה במרק סויה טריפטי (TSB) באמצעות אינקובטור רועד להגדיר על 37 מעלות צלזיוס. עבור מחקרים אלה, 20 מ"ל של TSB בצלוחיות נפרדות של 150 מ"ל Erlenmeyer חוסנו בתרביות קפואות של זני S. aureus USA300 או USA300ΔsaeR/S וגודלו במשך כ-14 שעות עם רעידות ב-250 סל"ד.
- תת-תרבית S. aureus על ידי ביצוע דילול 1:100 של תרבית חיידקים בן לילה עם מדיה טרייה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם רעידות עד שהחיידקים מגיעים לשלב הצמיחה הנייח המוקדם.
הערה: עבור ניסויים אלה, 20 מ"ל של מרק סויה טריפטי ב 150 מ"ל צלוחיות Erlenmeyer חוסנו עם 200 μL של תרבית לילה USA300 או USA300ΔsaeR/S והודגרו ב 37 ° C עם רעד ב 250 סל"ד במשך 5 שעות.
- כאשר חיידקים הגיעו לשלב הצמיחה הנייח המוקדם, העבירו 1 מ"ל של S. aureus תת-תרבית לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאחר הצנטריפוגה, מעבירים את הסופרנאטנט למזרק בנפח 3 מ"ל. העבירו סופרנאטנטים דרך מסנן של 0.22 מיקרומטר לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ"ל על קרח.
- לבצע דילולים סדרתיים של supernatants עם מדיה קרה כקרח המשמש לתרבית S. aureus.
הערה: עבור הניסויים המוצגים, סופרנאטנטים מ-USA300 ו-USA300ΔsaeR/S עברו ארבעה דילולי עץ רצופים של 1/2 עם TSB קר כקרח.
- הוסף בעדינות דגימות סופרנאטנט או מדיה בלבד (לבקרות שליליות וחיוביות) לבארות בודדות של לוחות 96 בארות המכילות PMN על קרח משלב 1.15. עבור ניסויים אלה, 10 μL של USA300 או USA300ΔsaeR/S דגימות supernatant נוספו לכל באר. צלחת סלע בעדינות להפיץ supernatants בבארות לדגור ב 37 ° C.
- בזמנים רצויים, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומניחים אותה על קרח. הוסף 40 μL של 0.5% Triton X-100 לבאר הבקרה החיובית.
- יש לסדר בעדינות את הדגימות מעלה ומטה בכל באר כדי למשוך את כל ה-PMN הדבוקים לצלחת לחלוטין, ולאחר מכן להעביר את הדגימות לצינורות ציטומטריה זורמים על קרח המכילים 300 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח עם 1 μL של יודיד פרופידיום.
- מדדו את חלקם של PMN חיוביים ליודיד פרופידיום באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2A). כאשר הוא קשור לדנ"א, לפרופידיום יודיד יש עירור/פליטה ב-535/617 ננומטר.
