בדיקת ציטוטוקסיות של זני סטפילוקוקוס זהוב על נויטרופילים בעקבות פגוציטוזה

תקציר

מקור: Dankoff, J. G. et al., כימות ציטוטוקסיות של Staphylococcus aureus נגד לויקוציטים פולימורפוגרעיניים אנושיים. J. Vis. Exp. (2020)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה לזיהוי ציטוטוקסיות של זני Staphylococcus aureus אלימים ופחות אלימים נגד נויטרופילים אנושיים בעקבות פגוציטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

1. בדיקת ציטוטוקסיות של S. aureus כנגד לויקוציטים פולימורפו-גרעיניים אנושיים בעקבות פגוציטוזה

הערה: עקומות גדילה המוגדרות על ידי צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD600) וריכוז החיידקים חייבות להיקבע אמפירית כדי שזני S. aureus ייבדקו לפני תחילת בדיקה זו. הצלחת ניסויים אלה דורשת קציר עקבי של ריכוזים שווים של כל זן S. aureus שנבדק בשלב הגידול המעריכי האמצעי באמצעות OD600 של חיידקים תת-מתורבתים.

1. התחל בן לילה תרביות של זני S. aureus וחיידקי תת-תרבית כמתואר להלן.
   1. תרבית S. aureus לילה במרק סויה טריפטי (TSB) באמצעות אינקובטור רועד להגדיר על 37 מעלות צלזיוס. עבור מחקרים אלה, 20 מ"ל של TSB בצלוחיות נפרדות של 150 מ"ל Erlenmeyer חוסנו בתרביות קפואות של זני S. aureus USA300 או USA300ΔsaeR/S וגודלו במשך כ-14 שעות עם רעידות ב-250 סל"ד.
   2. תת-תרבית S. aureus על ידי ביצוע דילול 1:100 של תרבית חיידקים בן לילה עם מדיה טרייה. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C (75 °F) עם רעידות.
2. קציר תת-תרבית S. aureus כאשר הוא הגיע לצמיחה מעריכית בינונית על ידי העברת 1 מ"ל של חיידקים בתרבית לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצנטריפוגה ב -5,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: בתנאי הצמיחה שלנו, USA300 ו-USA300ΔsaeR/S הגיעו לשלב הצמיחה האמצעי-מעריכי לאחר דגירה של כ-135 דקות.
3. יש לשטוף את S. aureus לאחר הצנטריפוגה על ידי שאיפת הסופרנטנט, השעיית החיידקים הכדוריים ב-1 מ"ל של DPBS, ערבול הדגימה במשך 30 שניות וצנטריפוגה ב-5,000 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
4. Opsonize S. aureus על ידי השעיית גלולת החיידקים ב 1 מ"ל של 20% סרום אנושי מדולל עם DPBS ודגירה ב 37 ° C עם תסיסה במשך 15 דקות.
5. צנטריפוגות opsonized חיידקים ב 5,000 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשטוף את S. aureus לאחר הצנטריפוגה על ידי שאיפת הסופרנטנט, להשהות מחדש את החיידקים הכדוריים ב-1 מ"ל DPBS, ולאחר מכן לערבל את הדגימה עד שהגלולה החיידקית מתפרקת לחלוטין בתוספת 30 שניות נוספות. חיידקי צנטריפוגה ב 5,000 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
6. להשהות מחדש זני S. aureus opsonized ב 1 מ"ל סל"ד, מערבלים את הדגימה עד שהגלולה החיידקית מתפרקת לחלוטין, ולאחר מכן למשך 30 שניות נוספות. מניחים חיידקים על קרח.
7. לדלל זני S. aureus מדוללים לריכוז הרצוי בסל"ד קר כקרח. מערבולת במשך 30 שניות ומניחים על קרח.
8. אשר את הריכוז של S. aureus opsonized על ידי ציפוי 1:10 דילול סדרתי של חיידקים על אגר סויה טריפטי.
   הערה: מאחר שלהבדלים בריכוז החיידקים שבהם נעשה שימוש בבדיקה זו יכולה להיות השפעה משמעותית על חדירות קרום הפלזמה של PMN לאחר מכן (איור 1A), חיוני שהריכוז של כל זן שנבדק ייקבע עבור כל ניסוי ויהיה שווה ערך בין הזנים.
9. הוסיפו בעדינות 100 μL/well מכל זן S. aureus או RPMI (לבקרות חיוביות ושליליות) ל-PMN בצלחת 96 בארות על קרח. צלחת סלע עדינה להפיץ S. aureus בבארות.
10. סנכרן פאגוציטוזה על ידי צנטריפוגה של הצלחת ב 500 × גרם במשך 8 דקות ב 4 ° C. לדגור את הצלחת ב 37 ° C מיד לאחר צנטריפוגה (T = 0).
11. בזמנים רצויים, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור ומניחים אותה על קרח. הוסף 40 μL של 0.5% Triton X-100 לבאר הבקרה החיובית.
12. יש לקלף בעדינות את הדגימות מעלה ומטה בכל באר כדי למשוך את כל ה-PMN המודבקים לצלחת לחלוטין, ולאחר מכן להעביר את הדגימות לצינורות ציטומטריה זורמים על קרח המכילים 200 μL של DPBS קר כקרח עם 1 μL של יודיד פרופידיום.
13. ניתוח דגימות עבור צביעת יודיד פרופידיום באמצעות ציטומטריית זרימה.
14. מדוד את חלקם של PMN חיובי ליודיד פרופידיום באמצעות ציטומטריית זרימה. כאשר הוא קשור לדנ"א, לפרופידיום יודיד יש עירור/פליטה ב-535/617 ננומטר.

תוצאות

איור 1: ניתוח ציטומטריית זרימה של PMN בעקבות פגוציטוזה של S. aureus. (A) שיעור ה-PMN החיובי לפרופידיום יודיד 90 דקות לאחר הפאגוציטוזה של ריכוזים שונים של USA300 או USA300∆saeR/S. (B) ריכוז זני S. aureus ששימשו לניסויים מוצג בלוח A. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM של 4 ניסויים נפרדים עם * p ≤ 0.01 כפי שנקבע על ידי מבחן t דו-זנבי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל עם מכסי הצמדה	VWR	89000-044	משמש לשטיפת תאים
צינורות תרבית 12x75 מ"מ	VWR	60818-430	משמש צינורות ציטומטריה זרימה
50 מ"ל צינורות צנטריפוגות חרוטיות	VWR	89039-656	לחלוקת מדיה
ציר סויה טריפטי Bacto, סויה-קזאין Digest בינוני	פישר סיינטיפיק	211823	לגידול תרביות תאים
המוציטומטר קו בהיר	סיגמא-אולדריץ'	Z359629	מנגנון ספירת תאים
DPBS, 1x (מלח חוצץ פוספט של Dulbecco) עם סידן ומגנזיום	קורנינג	21-030-CV	משמש לשטיפת תאים
Ficoll-Paque PLUS	GE שירותי בריאות	17-1440-02	טיהור PMN
פישרברנד פיפס סרולוגי סטרילי פוליסטירן חד פעמי	פישר סיינטיפיק	13-678-11E	לשאיפת נוזלים
גריינר סלסטאר 96 צלחות באר	מיליפור סיגמא	M0687	צלחת להחזקת דגימות ניסוי
מסנני מזרקי אומיקרון	אומיקרון סיינטיפיק	SFPV13R	לסינון סופרנאטנטים
פרופידיום יודיד	תרמופישר סיינטיפיק	P3566	כתם DNA בלתי חדיר בקרום
PYREX מותג 4980 צלוחיות Erlenmeyer	קול-פרמר	EW-34503-24	לגידול תרביות תאים
RPMI 1640, 1X ללא L-גלוטמין, פנול אדום	קורנינג	17-105-CV	משמש בהשעיית תאים
טריטון X-100	סיגמא-אולדריץ'	X100	שלמות הממברנה שליטה חיובית

מחדש