כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. זנים ותנאי תרבות
הערה: זן שחפת CDC1551 משמש במחקר זה, אך ניתן להשתמש בכל זן שחפת באותו אופן.
- גדל את החיידקים ב- M-OADC-TW (מרק 7H9 בתוספת 0.5% גליצרול, קומפלקס דקסטרוז 10% חומצה אולאית ללא קטלאז, ו- 0.05% Tween-80) בינוני העומד על 37 ° C עד OD600 של 0.5 (~ 0.2 x 107 יחידה יוצרי מושבה או CFU).
- לדלל את התרבית M-OADC-TW (סדרה של דילול 1:10 של החיידקים). צלחת את דילול החיידקים (10,5, 10,6, 10,7, 10,8) במשולש על לוחות 7H11 סלקטיביים כדי לאפשר קביעה של CFU.
- לדגור על הצלחות במשך ארבעה שבועות ב 37 ° C או עד מושבות ניתן לספור במדויק.
- צנטריפוגה את החיסון החיידקי ב 8,534 x גרם במשך 5 דקות כדי לקבל כדור. שטפו את הגלולה פעם אחת עם 10 מ"ל מי מלח (0.9% NaCl) והשהו מחדש את הגלולה ב-15 מ"ל מלח (0.9% NaCl).
2. זיהום אירוסול של עכברים באמצעות חדר מדיסון
- אפשרו לעכברים להתאקלם בסביבה החדשה למשך שבוע.
- שקלו את העכברים לפני שאתם מעמיסים אותם לתא.
- חבר שלושה כבלים למפצל החשמל: מתח התא הראשי, משאבת הוואקום ומדחס האוויר, בסדר זה.
- פתחו בזהירות את צנצנת הזכוכית. הביאו את צנצנת הזכוכית לארון הבטיחות הביולוגית והוסיפו את חיסון האתגר המרחף ב 15 מ"ל של מלוחים (0.9% NaCl) כדי להשיג ~ 104 - 106 CFU של חיידקים בריאות.
- סגור את מכסה צנצנת הזכוכית בארון הבטיחות הביולוגית. חברו את הצנצנת ליחידת הנבולייזר והתאימו את צינור הנירוסטה האנכי כך שהקצה התחתון (הכניסה) יהיה כרבע סנטימטר מתחת למפלס הנוזל בצנצנת.
- העמיסו את כל בעלי החיים הדרושים לניסוי (התא יכול להכיל עד 90 עכברים) לתוך התא וסגרו את כל התפסים בדלת.
- בדוק את מד זרימת האוויר הראשי (בחדר). ודא שמרכז הציפה (הכדור) פועל כ- 50 ליטר לדקה כפי שנמדד בסולם משמאל.
- לחץ על לחצן התחל בלוח הבקרה של התא. הגדר את קצב זרימת האוויר דרך מד זרימת האוויר של המדחס (המונה הקטן יותר משמאל) כ- 4 ליטר לדקה בסולם. בדוק חזותית כדי לוודא כי החיסון האתגר הוא ערפילי.
- לאחר 15 דקות, כאשר הנורה האדומה בחזית לוח הבקרה מופיעה ואות נשמע מציין את סוף הריצה, לחץ על לחצן איפוס בפינה הימנית התחתונה של לוח הבקרה כדי לאפס את הטיימרים.
- לחצו לחיצה ממושכת על הכפתור האדום הקטן בדלת התא כדי לשחרר את הוואקום.
- פתחו את דלת התא והוציאו את בעלי החיים. החזירו את העכברים לכלוביהם.
- הסר את צנצנת נבולייזר הזכוכית והנח אותה במיכל הובלה אטום וחסין נזילות. הניחו את המיכל בתוך ארון הבטיחות הביולוגית והשליכו את מתלה האתגר למיכל פסולת ייעודי.
- הניחו את צנצנת הנבולייזר המשומשת בתוך שקית מסוכנת ביולוגית ואטמו את השקית להובלה לאוטוקלאב.
- בסוף הליך הזיהום, לרסס את החלק הפנימי של החדר עם פנול חוצץ ו 70% אתנול ולאפשר את החדר לשבת במשך 10 דקות.
- לאחר מכן, נגבו היטב את כל המשטחים הפנימיים הנגישים. יש להשליך את כל מגבות הנייר המזוהמות וכו'. באשפה המסוכנת ביולוגית. אוטוקלבו את האשפה, מיכלי האשפה וצנצנות נבולייזר משומשות.
- החזירו את בעלי החיים לחדר ההכלה עד לנקודת הזמן של ההדמיה.
- ביום ההדמיה מעבירים את בעלי החיים במיכל משני לחדר ההדמיה.
3. הרדמה של בעלי חיים
- מרדימים את העכברים עם איזופלורן באמצעות מערכת הרדמה גזית מותאמת אישית.
- שקלו כל אחד משני מכלי מסנן הפחם הממוקמים על גבי יחידת ההרדמה.
- יש להחליף במיכל חדש אם המשקל גבוה ב-50 גרם מהמשקל ההתחלתי.
- בדוק את יחידת הוופורייזר כדי לוודא איזופלורן מספיק עבור ההליך.
- הניחו את מחזיק חרוט האף בתוך תא ההדמיה. מניחים את מספר חרוטי האף הדרושים להליך ואוטמים את הפתחים הנותרים עם חוסמי חרוטי האף.
- הפעל את אספקת החמצן מהגליל בלחץ גבוה והגדר אותו על 55 psi.
- הפעילו את משאבת הפינוי הממוקמת מול יחידת ההרדמה וכוונו אותה ל-8 ליטר/דקה.
- הפעל את מתג החמצן הממוקם לפני יחידת ההרדמה.
- הפעל את זרימת הגז לתא השראת ההרדמה כדי להגדיר את זרימת הגז על 1.5 ליטר לדקה. כבה את זרימת הגז.
- הפעל את זרימת הגז לתא ההדמיה כדי להגדיר את זרימת הגז על 0.25 ליטר/דקה. כבה את זרימת הגז.
- הפעל את וופורייזר isoflurane ולהגדיר אותו על 2 - 2.5%. התאם את רמת האיזופלורן בהתאם למספר ומשקל בעלי החיים המשמשים לניסוי על ידי סיבוב החוגה על וופורייזר האיזופלורן (2 - 2.5% עבור עכבר השוקל ~ 20 גרם; 4% עבור שרקן במשקל 300 גרם).
- הכניסו את העכברים לתא ההרדמה וסגרו את המכסה. הפעל את זרימת הגז לתא השראת ההרדמה.
- השאירו את העכברים בתא השראת ההרדמה למשך 5 - 10 דקות עד להרדמה מלאה.
- לאחר הרדמת העכברים, יש למרוח משחה אופטית על העיניים כדי להגן עליהן בזמן ההדמיה.
- מקם את העכברים בשכיבה גחונית או עצם החזה כך שהאף שלהם ממוקם בחרוט האף כדי להקל על הרדמת העכברים במהלך הליך ההדמיה.
4. הדמיית אנזים פלואורסצנטי (REF) כתב
- יש להזריק את המצע (20 מיקרומטר, 2.5 מיקרוליטר/גרם משקל) על ידי הזרקה תוך צפקית לעכברי הביקורת הנגועים וכן לעכברי הביקורת. העכברים נמצאים תחת הרדמה בתוך תא ההדמיה למשך פחות מדקה.
- הפעל את מערכת ההדמיה.
- אתחל את המערכת על-ידי לחיצה על Initialize. המתן עד שסרגל הטמפרטורה יהפוך לירוק.
הערה: תא ההדמיה מורכב מפלטפורמה מחוממת כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של בעל החיים בזמן ההדמיה.
- להגדרת רכישת הדמיה, בחר פלורסנט | הארה טרנסית לחיה שלמה או אפי-תאורה לרקמות ריאה, מבנה וכיסוי בלוח הבקרה לרכישה.
- הגדר את שדה הראייה ל- B עבור עכבר יחיד ואת רמת המנורה לגבוהה.
- הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, בינינג בינוני, 2 - 3 עבור f/stop, ומסנן עירור ל- 745 ננומטר ומסנני פליטה מ- 780 ננומטר ל- 840 ננומטר.
- להגדרת רצף, לחץ על הגדרת רצף, ובחר 9 - 12 נקודות הארה טרנסית באזור הריאות.
- לחץ על רכוש לרכישת תמונה.
- החזירו את העכבר לכלוב לאחר ההדמיה.
- עקוב אחר העכברים עד להחלמה מלאה או הקריב אותם לכימות CFU אם הדמיה בנקודת זמן של הניסוי. בצע ציון קרנופסקי שונה כדי לפקח על רווחתם של עכברים לאחר ההדמיה.
