כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. בידוד והתמיינות של מקרופאגים שמקורם במח עצם (BMM)
- יום 0: הקריבו נקבת עכבר C57BL/6 או BALB/c בת 4 - 6 שבועות בתא CO2 ואשרו מוות באמצעות פריקת צוואר הרחם. הקפידו על עיקור מספריים ומלקחיים על ידי השארתם ספוגים באתנול 70%. יש לרסס כפפות עם 70% אתנול כדי לאפשר טיפול סטרילי לאורך כל תהליך בידוד תאי מח העצם.
- הצמידו את העכבר שהוקרב ללוח הדיסקציה על ידי הצמדת גפיו הקדמיות וחיטוי שלו על ידי ריסוס רב באתנול 70%.
- בצע חתך קטן (כ 1 ס"מ) עם מספריים ליד מפרק הירך. בזהירות להכניס מספריים מתחת לעור כדי להפריד את השריר התחתון לחתוך את העור סביב מפרק הירך.
הערה: ניתן לסובב את לוח הדיסקציה כדי לאפשר גישה משופרת למפרק הירך.
- יש להסיר בזהירות את העור מהרגל על ידי משיכה לכיוון הקרסול והסרתו. חתכו את כף הרגל בקרסול, הקפידו מאוד לחתוך במפרק הקרסול או מתחתיו כדי להשאיר את השוקה שלמה לחלוטין.
הערה: הפיבולה בשלב זה מחוברת באופן רופף וניתן להפריד אותה בקלות באמצעות המלקחיים.
- אתר ידנית את מפרק הירך על ידי מניפולציה של עצם הירך כדי לזהות את נקודת הסיבוב. בזהירות להשתמש מספריים לחתוך את הרגל מעל מפרק הירך כדי להשאיר את הראש הפרוקסימלי של עצם הירך שלם.
- הסר כמה שיותר שריר ורקמת חיבור מהרגל עם מספריים. יש להסיר את שאריות העור מהקרסול וכל חומר עצם עודף מעל מפרק הירך.
- הניחו את עצמות הרגליים הנקיות ב-Roswell Park Memorial Institute RPMI סטרילי בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 1%) בצלחת פטרי על קרח.
- חזור על שלבים 1.4 עד 1.6 כדי לבודד את השוקה ועצם הירך מהרגל האחורית השנייה.
- הסר את כל השרירים ורקמת החיבור שנותרו מהעצמות השרויות בסל"ד באמצעות מלקחיים מעוקרים ולהב #10 סטרילי.
- מניחים עצמות על מכסה צלחת פטרי. חותכים את השוקה בזהירות עם הלהב מיד מעל מפרק הקרסול כדי לגשת למח. הסר את השוקה משאר הרגל על ידי חיתוך מיד מתחת למפרק הברך.
- יש לשאוב סל"ד סטרילי של 10 מ"ל בתוספת פניצילין/סטרפטומיצין (ריכוז סופי של 1%) לתוך מזרק של 10 מ"ל ולחבר מחט של 25 גרם.
- החזק את השוקה בחוזקה עם מלקחיים, אנכית מעל צינור חרוטי 50 מ"ל על קרח. השתמש במזרק כדי להזריק בעדינות כ 5 מ"ל סל"ד לתוך קצה העצם כדי לשטוף את מח העצם מהקצה השני לתוך הצינור החרוט. לשטוף את מח העצם עם סך של 10 מ"ל סל"ד עד העצם הופך לבן.
הערה: לאחר שטיפה יסודית, העצם צריכה להפוך לבנה. אם לא, המשיכו לשטוף כדי להסיר מח. ייתכן שיהיה צורך לחתוך את הקצה הדיסטלי של השוקה בחזרה עם הלהב אם הוא צר מכדי להחדיר את המחט.
- חתכו את עצם הירך מיד מעל מפרק הברך ומיד מתחת למפרק הירך כדי לחשוף את שני קצוות העצם כדי לגשת למח המוח. סומק מח עצם מעצם הירך עם סך של 10 מ"ל סל"ד באותו אופן כמו השוקה.
- חזור על שלבי ניקוי ושטיפה 1.6 עד 1.13 עם העצמות הנותרות ואסוף את התאים הסמוקים של מח העצם בצינור חרוטי יחיד של 50 מ"ל
הערה: אם עצם נשברת בשלב כלשהו במהלך הדיסקציה לפני שטיפת העצם, אין להשתמש במח עצם זו.
- צנטריפוגה הצינור החרוטי המשמש לאיסוף מח עצם סמוק מכל ארבע העצמות במשך 10 דקות ב 4 ° C ב 300 x גרם.
- יש להכניס 60 מ"ל של מדיום BMM סטרילי (סל"ד עם ריכוז סופי של 20% נסיוב בקר עוברי, FBS, 1% פניצילין/סטרפטומיצין, 1.2 מ"מ Na-פירובט, 25 מיקרוגרם/מ"ל גורם מגרה מושבת מקרופאגים אנושי (M-CSF) לתוך בקבוק תרביתתאים בגודל 175 ס"מ עם מכסה מסנן.
- יש להשליך את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה ולהשהות מחדש את כדורית התא על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה באמצעות 5 מ"ל של מדיום BMM מהצלוחית.
- העבירו את תרחיף התאים לבקבוק התרבית ושטפו את הצינור החרוטי פעמיים עם מדיום BMM מבקבוק התרבית כדי להבטיח התאוששות תאים מקסימלית. יש לוודא שתרחיף התאים מעורבב היטב בתווך, ולפזר 30 מ"ל מהבקבוק הראשוני של תרביתתאים בגודל 175 ס"מ 2 לבקבוק תרבית תאיםשני בגודל 175 ס"מ עם מכסה מסנן.
- יש לדגור על שתי הצלוחיות המכילות תרחיף תאים של 30 מ"ל כל לילה בטמפרטורה של 37°C, 5% פחמן דו-חמצני (CO2) כדי לאפשר הפרדה של פיברובלסטים מזהמים, מקרופאגים תושבים ותאים דבקים אחרים.
- יום 1: מעבירים את הסופרנאטנט המכיל תאי מח עצם לא ממוינים מצלוחיות לצלחות פטרי פוליסטירן בגודל 100 מ"מ x 15 מ"מ שאינן מטופלות ב-TC בכ-10 מ"ל/צלחת ודגורות ב-37°C, 5% CO2.השליכו את הצלוחיות.
- יום 3 או 4: הוסיפו 5 מ"ל BMM בינוני נוסף (מחומם מראש ל-37°C) לכל צלחת פטרי והמשיכו לדגור ב-37°C, 5% CO2.
2. ציפוי BMM על כיסויים לזיהום (יום 7 או 8)
- הכינו לוחות תרבית רקמה של 6 בארות על ידי הנחת ארבעה (4) כיסויי זכוכית סטריליים בקוטר 12 מ"מ (אוטומטיים ומאוחסנים במיכל זכוכית סגור) בתחתית כל באר ריקה.
הערה: בחרו כל כיסוי סטרילי בקוטר 12 מ"מ עם קצה שואף המותאם לקו ואקום. מניחים את הכיסויים לתוך הבארות ללא חפיפה, ומשחררים אותם במיקום הרצוי על ידי צביטת הצינור כדי להפריע לוואקום.
- יש לשאוף מדיה (וכל התאים שאינם דבקים) מצלחות פטרי מצופות במקרופאגים דבקים שמקורם במח עצם ולשטוף בעדינות תאים דבקים 2x במי מלח חוצצים פוספט סטרילי של דולבקו ללא סידן ומגנזיום כלורי (PBS -/-) שחומם מראש ל-37°C.
- הוסף טיפתית, 5 מ"ל סטרילי 1x PBS -/- עם ריכוז סופי של 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) לכל צלחת פטרי ודגור במשך 5 דקות ב 37 ° C כדי לנתק BMM דבק. ודא כי התאים מנותקים באמצעות מיקרוסקופ.
- לאסוף את כל התאים מנותקים מרחפים 1x PBS -/- בתוספת 1 mM EDTA בצינור חרוטי 50 מ"ל. יש לשטוף כל צלחת פעמיים עם 5 מ"ל PBS -/- ולהוסיף לבריכת התרחיף של התא.
הערה: ניתן לדלל את תרחיף התאים עם PBS נוסף -/- כדי להגן על מקרופאגים מפני רעילות EDTA במהלך תהליך האיסוף.
- צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות ב 4 ° C. להשליך supernatant ו resuspend מקרופאגים ב 5 - 10 מ"ל BMM בינוני על ידי pipetting. הניחו תאים מרחפים על קרח כדי למנוע היצמדות לצינורות והצטברות.
- ספירת תאים קיימא באמצעות הדרה כחולה טריפאן בהמוציטומטר.
הערה: כדי לספור תאי BMM מרחפים מחדש בתווך 5 מ"ל, תערובת דילול של 25 μL תרחיף תאים ב 445 μL PBS -/- ו 30 μL 0.4% תמיסה כחולה טריפאן בדרך כלל מאפשרת כימות קל בהמוציטומטר (תוך התחשבות במקדם דילול פי 20 לחישוב הסופי). ספרו רק תאים שלא הוכתמו בכחול טריפאן (תאים ברי קיימא). נפח תרחיף התאים עשוי להשתנות אם תערובת זו מרוכזת או מדוללת מדי. באופן כללי, התשואה של BMM לכל הכנה משתנה בין 2 x 107 ו 5 x 107 תאים מעכבר יחיד.
- מכינים את תרחיף התא בתווך BMM בריכוז הציפוי הרצוי (5 x 105/מ"ל) ומפזרים את התרחיף ל 6 לוחות באר ב 2 מ"ל בינוני לכל באר כך שכל באר מקבלת 1 x 106 מקרופאגים.
הערה: זהו צעד קריטי שמבטיח שכל באר תקבל מספר מספיק של מקרופאגים כדי לכסות את הכיסויים באופן אחיד. בדקו שהכיסויים בבארות אינם חופפים או צפים בתווך. אם כן, יש לכוונן בעדינות עם קצה פיפטה סטרילי.
- יש לדגור למשך הלילה ב-37°C, 5% CO2.
3. טיהור צורות זיהומיות של לישמניה אמזוננסיס
הערה: הכינו לישמניה לזיהומים - טהרו פרומסטיגוטים מטאציקליים מתרביות פרומסטיגוט נייחות, או הבדילו פרומסטיגוטים בתרבית לצורת אמסטיגוט באמצעות פרוטוקול התמיינות אקסני סטנדרטי של L. amazonensis.
- טיהור פרומסטיגוטים מטאציקליים של לישמניה באמצעות מדדי שיפוע צפיפות (חומרים)
- הכינו תמיסת מלאי של 40% משטח שיפוע צפיפות במים סטריליים נטולי אנדוטוקסינים.
- יש לדלל את תמיסת שיפוע הצפיפות בתווך M199 10x (ללא סרום) כדי להכין ריכוז של 10% בתווך M199.
- סנן את כל הפתרונות דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
הערה: פתרונות מלאי ניתן לאחסן ב 4 oC בחושך לא יותר מ 1 חודש.
- הוסף 2 מ"ל של תמיסת מדיה הדרגתית בצפיפות 40% בתחתית צינור צנטריפוגה חרוטי 15 מ"ל.
- שכבה 2 מ"ל של תמיסת מדיה עם שיפוע בצפיפות של 10% ב-M199 על גבי שכבת המדיה של מעבר הצבע בצפיפות של 40% בזהירות, תוך שימוש בפיפטת פסטר כדי למנוע ערבוב בין שתי השכבות.
- לאסוף 1 x 109 טפילים מתרבית בשלב נייח על ידי צנטריפוגה ב 1,900 x גרם במשך 10 דקות.
- תאי השהיה מחדש ב- 6 מ"ל מדיום חיוני מעובד של Dulbecco (DMEM).
- שכבה 2 מ"ל של תרחיף התא ישירות על גבי שכבת המדיה בעלת שיפוע הצפיפות של 10%, בעדינות, באמצעות פיפטת פסטר כדי למנוע ערבוב בין השכבות.
- צנטריפוגה את השיפוע למשך 10 דקות ב 1,300 x גרם בטמפרטורת החדר.
הערה: בשל הבדלים בתכונות הפיזיות בין מיני הלישמניה, ייתכן שיהיה צורך להתאים מעט את תנאי הצנטריפוגה עבור כל אחד מהם כדי להבטיח תפוקה מרבית.
- אספו טפילים (מועשרים בצורת פרומסטיגוט מטאציקלית) מהרצועה שנוצרה בגבול המדיה העליונה של שיפוע הצפיפות של 10% (ממשק בין שכבות המדיה של שיפוע הצפיפות 0% ו-10%).
- לדלל טפילים עם נפח אחד של DMEM ולאסוף על ידי צנטריפוגה (1,900 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר).
- השהה מחדש בתווך DMEM של 500 μL וספור בהמוציטומטר כדי לכמת את התשואה.
- יצירת L. amazonensis amastigotes בתנאי תרבית אקסנית (pH נמוך / טמפרטורה גבוהה)
- יש לערבב 5 מ"ל של תרבית פרומסטיגוט בשלב העץ (pH 7.4 ב-26 מעלותצלזיוס) עם נפח שווה של מדיום אמסטיגוט (pH 4.5), תוך שימוש ב-25 ס"מ2 צלוחיות (סה"כ 10 מ"ל בינוני), ולדגור ב-26 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- העבר את הבקבוק מ 26 °C ל 32 °C (75 °F).
- לאחר 3 או 4 ימים, לפצל תרבית 1: 5 במדיה amastigote ב 32 ° C.
- בדוק את הטפילים ב 3 - 4 ימים הבאים (מקסימום 7 ימים) כדי לראות אם הם מוכנים לשימוש בזיהומים.
הערה: אמסטיגוטות אקסניות בריאות צריכות להיות בעלות צורה אליפטית, ללא שוטונים גלויים. לאמסטיגוטים מובחנים חלקית יש צורה אליפסה גדולה עם שוטונים קצרים. התרבות לא צריכה להיות הרבה גושים - גושים רבים הם אינדיקציה של טפילים שאינם גדלים, גוססים. ניתן לפצל את תרבית האמסטיגוט ביחס של 1:5 ולשמור עליה למשך 3 שבועות לכל היותר.
4. זיהום עם L. amazonensis
- דילול תרחיפים של טפיל בהתאם לריבוי הזיהום הרצוי (MOI) (בדרך כלל 3-5 פרומסטיגוטים מטאציקליים לכל מקרופאג [MOI של 1:3 או 1:5] ו-1 אמסטיגוט לכל מקרופאג [MOI 1:1]). הוסף לישמניה ב- PBS -/- בנפח של 50 - 100 μL לכל באר שכבר מכילה 2 מ"ל בינוני.
- לדגור BMM במשך 1 שעה עם amastigotes ו 3 שעות עם promastigotes metacyclic ב 34 oC עבור זיהום.
הערה: טמפרטורת זיהום אופטימלית עשויה להשתנות בהתאם למין.
- לאחר הדגירה, יש לשטוף היטב טפילים חופשיים בכל באר 3x עם 2 מ"ל PBS -/- שחומם מראש ל 37 ° C.
הערה: פזרו PBS בעדינות כדי להבטיח שהכיסויים לא יצופו זה על זה. מערבלים בעדינות את הצלחת ואז שואפים החוצה את הנוזל. השתמש בקצה שאיפה נפרד אם אתה משתמש בזנים מרובים של טפילים כדי למנוע זיהום צולב.
- תקן דגימות נקודת זמן של שעה או 3 שעות על ידי דגירה של כל באר עם 1.5 - 2 מ"ל של 2% PFA ב- PBS -/- למשך 10 דקות. שטוף 3x עם PBS -/-. אין לשאוף לשטיפה אחרונה ולשמור במקרר צלחות המכילות כיסויים ב-PBS עד להכתמה.
- הוסף 2 מ"ל מדיום BMM טרי לכל באר על לוחות לנקודות זמן נוספות ודגר ב 34 ° C.
- תקן את נקודות הזמן הנותרות כמתואר בשלב 4.3, ושמור את הצלחות בקירור עד להכתמה.
5. 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) צביעה והרכבה מכסה
- שאפו PBS מבארות המכילות כיסויים והוסיפו 1.5 מ"ל PBS -/- עם 0.1% חומר ניקוי לא יוני. יש לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS 2 מ"ל -/-.
- הוסף 1 מ"ל PBS -/- עם 2 מיקרוגרם/מ"ל DAPI (מדולל מתמיסת מלאי של 5 מ"ג/מ"ל במים) לבארות המכילות כיסויים ודגרה במשך שעה נוספת בטמפרטורת החדר.
הערה: זמן הדגירה עם DAPI הוא קריטי להדמיה נכונה של טפילי לישמניה תוך תאיים. גרעיני המקרופאגים מכתימים במהירות, בשל גודלם הגדול יותר ותכולת החומצה הדאוקסיריבונוקלאית (DNA), אך צביעת גרעיני הטפילים התוך-תאיים איטית יותר. לפיכך, הארכת זמן הדגירה מעבר למה שנדרש כדי לדמיין את גרעיני BMM נחוצה כדי לאפשר ל- DAPI לחלחל דרך קרום הפלזמה של הטפיל וקרום הגרעין של הטפיל. עם כתם DAPI תקין, ניתן גם לדמיין את הדנ"א הקינטופלסטי המיטוכונדריאלי ליד כיס השוטון של הטפיל, בנוסף לדנ"א הגרעיני.
- שטפו כל באר המכילה כיסויים 3x עם PBS של 2 מ"ל -/- ולאחר מכן הרימו והפכו את הכיסויים עם מלקחיים כדי להניח את צד התא כלפי מטה ולהרכיב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית עם מגיב הרכבה נגד דהייה הזמין מסחרית.
הערה: כיסויים הם שבירים ביותר ודורשים טיפול זהיר. הימנע מהפעלת לחץ עליהם, במיוחד על דופן הבארות בעת הרמה. הוספת כמה טיפות של PBS -/- מפחיתה את מתח הפנים בין הכיסוי לבאר ומקלה על תהליך ההרמה. ניתן להשתמש במחט מדידה עדינה כדי לסייע בחטטנות בכיסויים מתחתית הבאר. לאחר הנחת מכסה על המגלשה, לחץ בעדינות כלפי מטה עם מלקחיים כדי לדחוף החוצה בועות אוויר באמצעי ההרכבה. אם החלקה נשברה או התהפכה במהלך תהליך ההרמה, אין להרכיב מחדש; פשוט השתמש בכיסוי הרביעי הרזרבי.
- מקררים שקופיות עד לכימות.
6. כימות זיהום
- בחן שקופיות מוכתמות ב-DAPI תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי התמקדות במקרופאגים באמצעות עדשה אובייקטיבית 100X עם שמן טבילה (עירור ב-358 ננומטר; פליטה אופטימלית ב-461 ננומטר).
ודא שהמיקוד הוא על שכבת המקרופאגים בין מגלשת הזכוכית לכיסוי.
- כמת את מספר המקרופאגים (גרעינים גדולים המוכתמים ב-DAPI) ואת מספר גרעיני האמסטיגוט הקטנים יותר המקובצים סביב כל גרעין מקרופאג (ראו איור 1A, DAPI) עבור כל שדה ראייה, באמצעות מונה ידני.
הערה: גרעיני אמסטיגוט עשויים שלא להיראות כולם במישור מיקוד אחד בשל גודלם הקטן. ספרו את אלה הנראים לעין כאשר התמקדו בגרעיני המקרופאגים, ולאחר מכן השתמשו במיקוד עדין כדי לבדוק אם קיימים גרעיני טפילים במישורים שמעל ומתחת לגרעיני המקרופאגים.
- עברו לשדה ראייה אחר כדי לחזור על הכימות. השתמש במפתח מונה נפרד כדי לעקוב אחר מספר השדות שנספרו. עבור בין שדות חזותיים בשורות מקבילות לאורך כל תלוש כיסוי, כדי למנוע חפיפה בין הספירה.
- כמת מינימום של 200 מקרופאגים לכל כיסוי. לכמת כל נקודת זמן של זיהום במשולש (3 כיסויים). ספור את תלוש הכיסוי הרביעי אם אחד הקודמים אינו מתאים לספירה עקב חפיפת כיסוי, הרכבה לקויה, שבירת זכוכית וכו '< / >
הערה: אם לא ניתן לספור 200 מקרופאגים על מכסה אחד, ספרו את הרביעי הרזרבי.
- חשב את שיעורי ההדבקה כאמסטיגוטים/מקרופאגים או אמסטיגוטים/100 מקרופאגים וקבע את אחוז המקרופאגים הנגועים מנתוני הכימות הגולמיים.
