$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. מעבר תרבויות אורגנואידים
- מוסיפים 1 מ"ל של מדיום בסיסי קר למטריצת המרתף בבאר. באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל, פיפטה נמרצת למעלה ולמטה עד שמטריצת המרתף נשברת. מעבירים לצינור של 15 מ"ל. מניחים על קרח.
- קח אורגנואידים בפיפטה ופיפטה נמרצת פי 10 למעלה ולמטה. שבירת האורגנואידים ניתן לראות על ידי העין.
2. מיקרו-הזרקה של תרבית אורגנואידים.
הערה: פרוטוקול זה יכול לשמש להזרקת חיידקים לאורגנואידים. זה עשוי להיות מועיל להתחיל את הזריקה עם אורגנואידים כי הם מתירניים יותר מיקרו-הזרקה. לדוגמה, אורגנואידים של קיבה עכברית יכולים לגדול לאורגנואידים ציסטיים גדולים מאוד שקל להתמקד בהם.
- הכנת חומר
- משוך נימי זכוכית לשתי מחטי הזרקה באמצעות מושך מיקרופיפטה, על פי המלצות היצרנים. מושך המיקרופיפטה יחמם את נימי הזכוכית באמצע וימשוך את הנימים לשני חלקים, ובכך ייצור שתי מחטי זכוכית. זה מעשי למשוך כמה מחטים ולאחסן אותם בצלחת פטרי נקי.
- כדי לאפשר זיהום חיידקי, יש להסיר את האנטיביוטיקה מכל המדיות למשך 3 שינויים בינוניים לפחות (=שבוע). זה ידלל אנטיביוטיקה ממטריצת המרתף. אם אתם משתמשים בזן חיידקי עמיד לאנטיביוטיקה ספציפית, הוסיפו אנטיביוטיקה ספציפית זו כדי למזער את הסיכויים לזיהום.
- הכינו את שולחן העבודה למיקרו-הזרקות. לעבודה ברמות בטיחות ביולוגית שונות, ייתכן שיהיה צורך להציב סטריאומיקרוסקופ בתוך ספסל סטרילי. בפרוטוקול זה, יש להזריק H. pylori בתנאי בטיחות ביולוגית 2 תחת סטריאומיקרוסקופ בתוך ספסל סטרילי.
- תרבית את החיידקים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
- כדי להעריך את ריבוי הזיהומים (MOI), אומד שני פרמטרים: מספר החיידקים ומספר התאים לכל אורגנואיד כמפורט להלן. MOI יכול להיות מתואם עם תוצאות, למשל עם ביטוי IL-8 mRNA של המארח.
- כדי לחשב את צפיפות החיידקים בתמיסת הזיהום, ראשית קבע את העקומה הסטנדרטית של צפיפות אופטית ויחידות יוצרות מושבה (CFU) על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. צפיפות אופטית של 0.1 ב-550 ננומטר אמורה להניב כ-107 יחידות יוצרות מושבה (CFU/ml).
- כדי להעריך את מספר התאים לכל אורגנואיד, ספרו את מספר האורגנואידים בבאר אחת. לשבש אורגנואידים כמתואר בשלבים 1.1-1.4. לאחר צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 x גרם ו 4 ° C, להוסיף 1 מ"ל של פתרון דיסוציאציה אנזימטית resuspend.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C עם טלטולים חוזרים ונשנים במשך 5-10 דקות. לקבוע אם התאים התנתקו לתאים בודדים תחת המיקרוסקופ (מיקרוסקופ הפוך כגון Leica DMIL בהגדלה פי 10). במידת הצורך להאריך את הדגירה.
- ספירת תאים לכל אורגנואיד באמצעות המוציטומטר וחישוב מספר התאים לכל אורגנואיד. אורגנואידי קיבה אנושיים בקוטר של כ-200 מיקרומטר מכילים כ-4,000 תאים. הזרקה של 0.2 μl של תמיסה חיידקית עם 1 x 109 חיידקים למ"ל מביאה MOI משוער של 50.
- הזרקת אורגנואידים.
הערה: עבור מיקרו-הזרקה, מחט הזכוכית מיוצבת במחזיק, אשר ניתן לתמרן בשלושה ממדים על ידי מיקרומניפולטור. אורגנואידים נשארים בתוך מטריצת המרתף בתוך הבאר. בשל גודל ומיקום בבאר, לא כל האורגנואידים מקובלים באותה מידה להזרקה. בדרך כלל, ניתן לכוון את 30 האורגנואידים הגדולים ביותר בבאר אחת תוך 5 דקות.
- קצרו חיידקים ושטפו אותם במדיום הבסיסי על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
- חשב את מספר החיידקים למ"ל בהתאם לצפיפות האופטית (ראה שלב 2.1.5.1). לדלל את החיידקים ל 1 x 109 חיידקים לכל מ"ל בתווך בסיסי.
- קח מחט זכוכית. באמצעות מלקחיים לשבור את הקצה כך הפתח יהיה כ 10 מיקרומטר רוחב.
- הכנס את המחט למחזיק ההזרקה וקבע אותה למיקרומניפולטור.
- קח בערך 10 μl פתרון חיידקי לתוך המחט.
- מניחים צלחת 4 בארות עם קצוות נמוכים המכילים תרביות אורגנואידים מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
- ניווט עם micromanipulator, לכוון אורגנואיד יחיד עם המחט. מקם את המחט קרוב לאורגנואיד ולאחר מכן הכנס את המחט לתוך האורגנואיד בתנועה מהירה אחת. הזריקו כ-0.2 מיקרוליטר תמיסה חיידקית לכל אורגנואיד באמצעות המיקרו-מזרק.
3. קציר אורגנואידים לכל ניתוח.
- לדוגמה, לתקן אורגנואידים לאחר 4 שעות. להסיר supernatant ולהוסיף 1 מ"ל 2% פורמלדהיד לדגור 20 דקות ב RT או O/N ב 4 ° C. אורגנואידים יכולים להיות מעובדים עבור immunohistochemistry על פי נהלים סטנדרטיים.