1. יצירת ספרייה של חלבון פלואורסצנטי ירוק, מוטציות טרנספוזון Coxiella transposon המתויגות ב-GFP
מניפולציה Coxiella burnetii RSA439 NMII ברמת הכלה של בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2) בארון בטיחות מיקרוביאלית (MSC) בהתאם לכללים המקומיים. אם תואם למודל החיידקי המשמש, חזור על שלבים מ- 1.4.1 ל- 1.4.4 כדי להגדיל את ההסתברות לקבלת מוטציות משובטיות. ספרייה מוטנטית טיפוסית מורכבת (לפחות) ממספר מוטנטים השווה פי שלושה ממספר רצפי הקידוד המתוארים בגנום של האורגניזם בו נעשה שימוש.
- הכנת Coxiella electrocompetent RSA439 NMII:
- הכנת 1x ציטראט ציטראט חומצי ציסטאין בינוני-2 (ACCM-2): 13.4 mM חומצת לימון, 16.1 mM נתרן ציטראט, 3.67 mM אשלגן פוספט, 1 mM מגנזיום כלורי, 0.02 mM סידן כלורי, 0.01 mM ברזל גופרתי, 125.4 mM נתרן כלורי, 1.5 mM L-ציסטאין, 0.1 גרם / ליטר Bacto Neopeptone, 2.5 גרם / ליטר חומצות קמינו, 1 גרם / L מתיל בטא ציקלודקסטרין, 125 מ"ל / L מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI). התאם את ה- pH ל- 4.75 וסנן סטריליזציה (לא autoclave).
הערה: נוזל ACCM-2 יציב ב 4 °C (75 °F) במשך כחודש אחד.
- חסן 100 מ"ל של ACCM-2 עם 2 x 106 שווה ערך לגנום (GE) / מ"ל של Coxiella RSA439 NMII (ממלאי חיידקים שנוצר בעבר וכומת כמו בשלב 1.5) ממלאי -80 ° C ופזר את התרחיף החיידקי ב 75 ס"מ2 צלוחיות תרבית תאים עם כובעים מאווררים (10 - 15 מ"ל של תרחיף חיידקי לכל בקבוק). לגדול במשך 7 ימים ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% פחמן דו חמצני (CO2) ו 2.5% חמצן (O2).
- אגרו את התרחיף החיידקי שנוצר בצינורות 50 מ"ל ובצנטריפוגה ב-3,900 x גרם למשך שעה אחת ב-4°C.
- יש להשליך את הסופרנאטנט ולהשהות מחדש את הגלולה ב-30 מ"ל של 10% גליצרול. צנטריפוגה ב 3,900 x גרם במשך 1 שעה ב 4 ° C.
- להשהות את הגלולה בנפח נאות של 10% גליצרול (בדרך כלל 2 מ"ל) ו aliquot 50 μl בצינורות 500 μl. שמור חיידקים מרחפים על קרח במהלך כל התהליך.
הערה: בשלב זה, חיידקים הם electrocompetent ו aliquot אחד מספיק כדי לבצע electroporation אחד. את התרחיפים החיידקיים ניתן לאחסן ב -80 ° C במשך 6 חודשים או לשמש ישירות עבור electroporation של חומצה deoxyribonucleic פלסמיד (DNA).
- אלקטרופורציה של קוקסיאלה מוכשרת עם פלסמידים מקודדים טרנספוזון וטרנספוזאז:
- מצננים מראש קובטת אלקטרופורציה בקוטר 0.1 ס"מ למשך 10 דקות על קרח. מערבבים 50 μl של Coxiella electrocompetent עם 10 מיקרוגרם פלסמיד transposon ו 10 מיקרוגרם של פלסמיד transposase. ודא כי ריכוז פלסמיד גבוה מ 500 מיקרוגרם / מ"ל כדי למזער דילול של גליצרול.
- אלקטרופורטאט באמצעות ההתקנה הבאה: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. ודא שקבוע הזמן המתקבל מורכב בין 9 ל- 13 מילישניות.
- מיד להוסיף 950 μl של RPMI, להשעות מחדש את החיידקים electroporated ולהעביר צינור מכסה בורג ולשמור בטמפרטורת החדר.
- קח 200 μl של חיידקים electroporated ולהוסיף 3 מ"ל של ACCM-2 בתוספת 1% סרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) לתוך צלחות 6 באר. הוסף 88 μl של dimethyl sulfoxide (DMSO) לנפח הנותר של חיידקים electroporated (כדי להגיע לריכוז סופי של 10% DMSO) ולאחסן ב -80 ° C.
הערה: עבור הפרוטוקול הבא, האלמנט הניתן להמרה והטרנספוזאז מקודדים על ידי שני פלסמידים שונים (pITR-CAT-GFP ו- pUC19-Himar1C9, בהתאמה). לשני הפלסמידים אין מקור שכפול ספציפי לקוקסיאלה, מה שהופך אותם לפלסמידים מתאבדים כאשר הם מתחשמלים בקוקסיאלה. הדבר מבטיח החדרות טרנספוזון יציבות. היסוד הניתן להעברה מכיל קסטת עמידות לכלורמפניקול תחת הרגולציה של מקדם קוקסיאלה p1169 לבחירה וגן gfp תחת רגולציה של מקדם קוקסיאלה p311 כדי לתייג את המוטנטים שנוצרו עם GFP.
- בחירת מוטציות הטרנספוזון:
- לדגור על צלחות 6 בארות מחוסנות כמתואר לעיל (1.2.4) לילה ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2 ו 2.5% O2. הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין או 3 מיקרוגרם / מ"ל כלוראמפניקול). לדגור על תרבית החיידקים במשך 3 ימים נוספים בתנאים שתוארו לעיל.
- בידוד מוטנטים בודדים:
- הכנת לוחות ACCM-2 מוצקים וציפוי של מוטציות טרנספוזון קוקסיאלה
הערה: ההוראות הבאות הן עבור צלחת פטרי אחת, יש לבדוק מספר דילולים של תרביות חיידקים כדי להעריך את נפח החיסון האופטימלי לבידוד מושבה.
- מחממים 10.5 מ"ל של 0.5% אגרוז במיקרוגל ומניחים לו להתקרר באמבט מים של 55 מעלות צלזיוס. יש לחמם 11.25 מ"ל של 2x ACCM-2 (pH 4.75) ב-37°C.
- הכינו אגרוז תחתון:
- יש לערבב 10 מ"ל של אגרוז 0.5% מומס עם 10 מ"ל של 2x ACCM-2 ולהוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין או 3 מק"ג/מ"ל כלוראמפניקול).
- יוצקים מיד לתוך צלחת פטרי. השאירו את צלחת הפטרי ללא מכסה, תנו למדיום להתקרר במשך 30 דקות, וייבשו באוויר במשך 20 דקות.
- הכינו אגרוז עליון:
- יש לערבב 1.25 מ"ל של 2x ACCM-2 עם 0.75 מ"ל מים בצינור פוליסטירן של 5 מ"ל, להוסיף את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין או 3 מק"ג/מ"ל כלורמפניקול) ולדגור ב-37°C.
- מוסיפים את תרבית החיידקים (בדרך כלל 1 עד 100 מיקרוליטר) ומערבלים למשך 5 שניות.
- מוסיפים 0.5 מ"ל של אגרוז מומס, מערבבים, ומיד יוצקים על האגרוז התחתון.
- מצננים במשך 20 דקות, מחליפים את המכסה על צלחת הפטרי ודגרים בחום של 4°C למשך 20 דקות כדי להקל על התמצקות האגרוז.
- יש לייבש באוויר במשך 20 דקות ללא מכסה ב-MSC. לגדל צלחות ב 37 ° C באווירה לחה של 5% CO2 ו 2.5% O2 במשך 6 עד 7 ימים.
- הוסף DMSO לתרביות החיידקים הנותרות על מנת להגיע לריכוז סופי של 10% DMSO ולאחסן ב -80 ° C.
- הערך את הדילול האופטימלי כדלקמן: ודא כי מושבות הן בקוטר 0.5 עד 1 מ"מ והן מבודדות כראוי כדי למנוע זיהום צולב. הפשירו את תרביות החיידקים שנותרו מנקודה 1.4.2 ופלטה בדילול המתאים על אגר ACCM-2 כמתואר ב-1.4.1.2 וב-1.4.1.3. יש לדגור במשך 6 עד 7 ימים כמתואר ב-1.4.1.3.5.
- לאחר שניתן לזהות מושבות, אספו אותן על ידי חיתוך קצה של 1 מ"ל, בחירת התקע המכיל מושבות מבודדות, ופיזור המושבה על ידי צנרת של 1.5 מ"ל ACCM-2 המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה (375 מיקרוגרם/מ"ל קנמיצין או 3 מק"ג/מ"ל כלורמפניקול) בצלחת של 24 בארות. הגבירו מושבות בודדות למשך 6 ימים בתנאים המתוארים ב-1.3.1. ביום השלישי של הדגירה, לפזר את גושי החיידקים על ידי pipetting כל תרבית.
- אחסנו כל מתלה מוטנטי בצינורות מכסה בורג ברקודים דו-ממדיים בלוחות 96 בארות ב-10% DMSO ב-80°C-.
- הערכת ריכוז חיידקים:
הערה: ניתן ליישם את הפרוטוקול הבא כדי להשיג את עקומות הגדילה של מוטנטים חיידקיים המשוכפלים בתווך אקסני (ראה 1.4.4).
- הכנת עקומה סטנדרטית:
- הכינו תמיסת מלאי של 2 מק"ג/מ"ל של DNA דו-גדילי (dsDNA) (בדרך כלל פלסמיד אקראי בגודל ובריכוז ידועים) בחומצה 1x Tris- ethylenediaminetetraacetic, EDTA (TE). הכינו דילולים טוריים פי 10 מתמיסת הציר כדי לקבל ריכוזים הנעים בין 2 מיקרוגרם/מ"ל ל-2 נ"ג/מ"ל. יש לפזר 50 מיקרוליטר מכל ריכוז לבארות בודדות של מיקרו-צלחת בעלת 96 בארות עם דפנות ותחתית שחורות (ראו טבלה של חומרים).
- לדלל את מגיב הכימות dsDNA 1:200 במאגר TE 1x ולהוסיף 55 μl של מגיב מדולל לכל דגימה במיקרו-צלחת של 96 בארות. מערבבים היטב בעזרת שייקר ודוגרים במשך 2 עד 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
- מדוד את הפלואורסצנטיות של הדגימות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי ומסננים עבור אורכי גל פלואורסצאין סטנדרטיים (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר).
- התווה את טווח ריכוז הפלסמיד כנגד קריאות עוצמת הפלואורסצנטיות.
- כימות תרחיף חיידקי:
- יש לוותר על 5 μl של 10% Triton X-100 לכל באר במיקרו-צלחת בעלת 96 בארות עם דפנות ותחתית שחורות (ראה טבלת חומרים). מוסיפים 50 מיקרוליטר של תרחיפים חיידקיים לכל באר ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, על שייקר צלחת.
- לדלל את מגיב הכימות dsDNA 1:200 במאגר TE 1x ולהוסיף 55 μl של מגיב מדולל לכל דגימה במיקרו-צלחת של 96 בארות. מערבבים היטב בעזרת שייקר ודוגרים במשך 2 עד 5 דקות בטמפרטורת החדר, בחושך.
- מדוד את הפלואורסצנטיות של הדגימות באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי ומסננים עבור אורכי גל פלואורסצאין סטנדרטיים (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר).
- כדי לקבל את ריכוז הדנ"א של החיידקים, התווה את קריאות הפלואורסצנטיות בתרשים שהתקבל בנקודה 1.5.1.4. חלק את ריכוז הדנ"א במסת גנום קוקסיאלה (2.2 fg) כדי לקבל ריכוזי חיידקים. תוצאות אקספרס שוות ערך לגנום/מ"ל.
- השליכו מוטנטים המציגים פגם גדילה משמעותי ב-ACCM-2.
2. תגובת שרשרת פולימראז מושבת פריימר יחידה (PCR), ריצוף וביאור
הערה: הפרוטוקול הבא הוא להגברת DNA של 96 דגימות, פיפטה רב ערוצית מומלצת לשלבים הבאים. טיהור עמודות של מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים וריצוף DNA עם פריימר ספציפי לטרנספוזון (2.3) מועבר בקבלנות משנה לחברה חיצונית.
- ודא כי פריימר ההגברה מתוכנן על מנת לבצע הכלאה בין 100 ל -200 זוגות בסיסים במעלה הזרם של חזרה טנדם הפוכה (ITR), כדי לקבל מוצרי PCR המכסים את אתר החדרת הטרנספוזון בגנום קוקסיאלה. הכן 3 מ"ל של תערובת PCR (1x מאגר נאמנות גבוהה, 200 μM deoxynucleoside triphosphate (dNTPs), 1 μM הגברה פריימר, 20 U/ml פולימראז DNA באיכות גבוהה) ולחלק 29 μl לכל באר בצלחת PCR 96 באר להגדיר על קרח. העברה של 1 μl של כל מוטנט בפאזה הנייחת ב-ACCM-2 לתערובת PCR.
- הפעל PCR עם דנטורציה ראשונית (98°C, דקה אחת), 20 מחזורי החמרה גבוהה (98°C, 10 שניות; 50°C, 30 שניות; 72°C, 90 שניות), 30 מחזורי החמרה נמוכה (98°C, 10 שניות; 30°C, 30 שניות; 72°C, 90 שניות) ו-30 מחזורי החמרה גבוהה (98°C, 10 שניות; 50 °C, 30 שניות; 72°C, 90 שניות) ולאחר מכן הארכה סופית ב-72°C למשך 7 דקות.
- לטהר מוצרי PCR באמצעות חרוזים מגנטיים ורצף DNA עם פריימר ספציפי לטרנספוזון. תכננו את הפריימר הספציפי לטרנספוזון עם טמפרטורת התכה חזויה המורכבת בין 50°C ל-75°C, תכולת GC בין 40% ל-60%, אורך בין 18 ל-25 נוקלאוטידים, ואתר חישול במורד הזרם של אתר הכלאת פריימר ההגברה ולפחות 100 זוגות בסיסים במעלה הזרם של זוג הבסיס הראשון של הטרנספוזון ITR.
- באמצעות תוכנת ניתוח רצפים, טען את הגנום השלם והמבואר של Coxiella burnetii 493 NMI. השתמש בפונקציה "יישור להפניה" כדי לטעון וליישר (לפוצץ) את תוצאות הרצף ולקבוע את אתר הטרנספוזיציה. השליכו מוטנטים עם קריאות כפולות שאינן תואמות ו/או מציגות אותן. כדי לפקח על הרוויה של ספריית המוטציות, שמור תיעוד של המופע של החדרות טרנספוזון מרובות באותו אתר.
3. תאים אאוקריוטים מתמודדים עם מוטציות קוקסיאלה וניטור גדילה תוך-תאית
הערה: פיפטה רב-ערוצית מומלצת לשלבים הבאים. זיהומים בוצעו בטריפליקטים במיקרו-צלחות סטריליות של 96 בארות עם קירות שחורים ותחתיות שטוחות ושקופות. wt Coxiella burnetii המבטא GFP סופק על ידי ד"ר רוברט היינזן.
- לגדל תאי Vero ב RPMI ללא פנול אדום בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) בהיעדר אנטיביוטיקה (מדיה RPMI מלאה).
- יום לפני ההדבקה, יש לשטוף תאי Vero מבקבוק תרבית תאים במפגש או תת-מפגש עם 10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS).
- נתקו תאי Vero על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת טריפסין EDTA לבקבוק תרבית התאים ודגרו במשך 3 עד 5 דקות ב-37°C באווירה לחה של 5%CO2.
- להשהות תאים ב 10 מ"ל של מדיה RPMI מלאה. לספור תאים ולהכין תרחיף תאים של 105 תאים לכל מ"ל.
- מוציאים 100 μl של מתלה התא בכל באר של צלחת שחורה 96 באר עם תחתית שקופה שטוחה.
- צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 400 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) כדי להקל על הידבקות התא בתחתית הבארות ולדגור לילה ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2.
- הפשירו את לוחות 96 הבארות המכילים את מוטציות קוקסיאלה ב-RT ודיללו 150 מיקרוליטר של תרחיף חיידקי ב-300 מיקרוליטר של סל"ד ללא פנול אדום ו-FBS בצלחת באר עמוקה בת 96 בארות.
- הסר מדיה מהמיקרו-צלחת המכילה תאי Vero ושחרר 100 μl/well של מוטנטים מדוללים של Coxiella (MOI של 100). השתמש באר A1 כבקרה שלילית (תאים לא נגועים) ובארות A2 ו- A3 כבקרות חיוביות (תאים נגועים ב- wt Coxiella המבטאים GFP במכפלות זיהומים (MOI) של 100 ו- 200).
- צנטריפוגה את הצלחת למשך 10 דקות ב 400 x גרם ב RT באמצעות מחזיק צלחת צנטריפוגה אטום אירוסול.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה לחה של 5%CO2 למשך שעתיים ולאחר מכן להחליף את התווך המכיל חיידקים ב-100 μl/well של מדיום סל"ד טרי ומלא.
- מדוד פלואורסצנטיות GFP כל יום במשך 7 ימים באמצעות קורא מיקרו-לוחות פלואורסצנטי ומסננים עבור אורכי גל פלואורסצאין סטנדרטיים (עירור ~ 480 ננומטר, פליטה ~ 520 ננומטר). כדי למנוע הפרעות עקב עיבוי ופיזור אותות בתווך התרבית, השתמש בעירור תחתון וברישום פליטה בקורא המיקרו-לוחות.
4. הכנת דוגמאות לרכישת תמונות אוטומטית
הערה: ההליך הוא עבור צלחת אחת של 96 בארות, להגדיל את הנפחים בהתאם. צעדים מ- 4.2 עשויים לנצל את מכונת הכביסה לצלחות.
- ביוםהשביעי לאחר ההדבקה, הסר את התווך מהצלחת והחלף אותו ב 50 μl/well של תווך טרי ושלם המכיל צבע פלואורסצנטי חדיר לתאים בדילול המתאים (בדרך כלל 1:1,000, כדי להיות מותאם לקו התא בשימוש). לדגור על תאים במשך 30 - 60 דקות ב 37 ° C באטמוספירה לחה של 5% CO2.
- יש להחליף את המדיום ב-50 μl/well של 4% paraformaldehyde (PFA) ב-PBS, לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן להסיר את החיץ המכיל PFA ולשטוף 3 פעמים עם PBS.
- יש להסיר PBS ולהוציא 50 מיקרוליטר/באר של תמיסת חסימה (0.5% אלבומין בסרום בקר, 50 מילימטר אמוניום כלוריד, NH4Cl ב-PBS, pH 7.4) בתוספת 0.05% סאפונין. יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות.
- החלף את תמיסת החסימה ב- 40 μl/well של תמיסת חסימה טרייה בתוספת סאפונין (כאמור לעיל) ובנוגדן גליקופרוטאין-1 (anti-LAMP1) הקשור לממברנה הקשורה לליזוזום בדילול של 1:500. דגירה צלחת במשך 30 דקות ב RT.
- הסר את פתרון החסימה ושטוף את צלחת 96 באר 5 פעמים עם 100 μl / well של PBS.
- יש להוציא 40 מיקרוליטר/באר של תמיסת חסימה בתוספת ספונין (כנ"ל), הנוגדן המשני המתאים המסומן פלואורסצנטית (בדילול של 1:1,000) כדי לחשוף את הנוגדן האנטי-LAMP1 המיושם בשלב 4.4, ועם Hoechst 33258 ב-5 מיקרוגרם/מ"ל. לדגור על הצלחת למשך 30 דקות ב-RT.
- הסר את פתרון החסימה ושטוף את צלחת 96 באר 5 פעמים עם 100 μl / well של PBS. השאירו את נפח PBS המתאים לשטיפה האחרונה בצלחת 96 באר, מכיוון שהתאים הקבועים לא אמורים להתייבש.
- ציירו את הצלחת מיד או אחסנו את הצלחת בטמפרטורה של 4°C, מוגנת מפני אור, לצורך ניתוח לאחר מכן.
5. רכישת תמונות
- קבל תמונות בתעלות GFP (488 ננומטר, חיידקים), Hoechst 33258 (350 ננומטר, גרעיני התא המארח), אדום (~ 555 ננומטר, סמן קרום התא), ואדום רחוק (~ 615 ננומטר, LAMP1) באמצעות מיקרוסקופ אוטומטי אפיפלואורסצנטי המצויד במטרה של 20X. לרכוש 21 שדות עצמאיים לכל באר כדי לצלם מינימום של 5,000 תאים לדגימה. החל מיקוד אוטומטי באמצעות ערוץ גרעיני התא המארח כהפניה. כאשר עובדים עם פתוגנים חיידקיים המדביקים אחוז נמוך של תאים מארחים, משתמשים יכולים להתאים את מספר השדות העצמאיים שצולמו לכל באר, על מנת להשיג לפחות 500 תאים נגועים לניתוח.
