בדיקת זיהום חיידקי לחקר אינטראקציות אנאירוביות בין חיידקים לתאים מארחים

תקציר

מקור: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאים מארחים. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים טכניקה להערכת היכולת של Porphyromonas gingivalis, חיידק פתוגני אנאירובי, להיצמד ולפלוש לתאי אנדותל של ורידים טבוריים אנושיים (HUVECs). לאחר הדבקת תאי המאכסן בחיידק, התאים המארחים עוברים ליזה כדי לשחרר חיידקים דבוקים ומופנמים. כאשר הליזט מצופה בתווך מתאים, נוכחות מושבות מעידה על אינטראקציות מוצלחות בין חיידקים לתאים מארחים.

פרוטוקול

הפרוטוקולים הבאים יתארו שיטות לגידול ולימוד הפלישה של המין האנאירובי, P. gingivalis; עם זאת, פרוטוקולים אלה עשויים לשמש למספר פתוגנים אנאירוביים. למרות HUVECs משמשים, פרוטוקול זה עשוי לשמש עבור תאים אאוקריוטים אחרים הן חיסוניים ולא חיסוניים.

1. שימוש ותחזוקה אנאירובית

הערה: P. gingivalis הוא אנאירוב רגיש לרמות נורמליות של חמצן נתקל באוויר הסביבה. סביבה אנאירובית מבוקרת חיונית לטיפוח P. gingivalis.

1. כאן, שמרו על אטמוספירה מלאכותית המוגדרת כגז אנאירובי מעורב (80% N₂, 10% H₂, 10% CO₂) בתא אנאירובי ויניל (איור 1A). השתמשו במנעל אוויר (איור 1B) להעברת פריטים מסביבת המעבדה לתא האנאירובי. נעילת האוויר פועלת ידנית, פעמיים טיהור עם גז N₂ לפני החדרת הגז האנאירובי המעורב.
2. השתמשו בטור לסילוק מימן גופרתי (איור 1C) לסילוק ללא תחזוקה של מימן גופרתי בלתי רצוי. הניחו מסיר לחות בתוך התא כדי להסיר H₂O שנוצר על ידי הזרז וכדי למנוע אירוסולים המאפשרים את התפשטות הזיהום.
   הערה: מימן גופרתי הוא תוצר לוואי מטבולי טבעי של חיידקים אנאירוביים רבים והצטברותו רעילה לחיידקים ועלולה לגרום נזק לאלקטרוניקה ולקצר את אורך החיים של זרז.
3. השתמשו בקופסת מאוורר כדי להפיץ את האטמוספירה של התא דרך זרז פלדיום, אשר מסיר חמצן בנוכחות מימן (איור 1D).
   הערה: מסנן אטמוספרי מחזורי (חלקיקי אוויר ביעילות גבוהה או HEPA) מסיר מזהמים הנישאים באוויר בגודל של 0.22 מיקרומטר ומעלה.
4. תרבית חיידקים אנאירוביים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס הממוקם בתוך התא האנאירובי. השתמש בטכניקות אספטיות סטנדרטיות בעת עבודה בתוך החדר האנאירובי.

2. הכנת חיידקים אנאירוביים

הערה: P. gingivalis הוא אירוסובלני וניתן לאחסן אותו בתנאים אירוביים, אך הוא לא יגדל בנוכחות חמצן ברמות גבוהות מ-6%. תא אנאירובי נחוץ לטיפוח נכון של P. gingivalis ומינים אנאירוביים אחרים (איור 1). הכשרה מתאימה וחינוך על שימוש בתא אנאירובי נדרשים לפני עבודה עם מיקרו אנאירובים.

1. אזנו את כל המדיה והצלחות הנוזליות לתנאים אנאירוביים למשך 12 שעות לפחות לפני הניסוי לסילוק שאריות חמצן.
2. מעבירים P. gingivalis ממקפיא -80 מעלות צלזיוס לתא אנאירובי, ונותנים להפשיר.
3. פס P. gingivalis על טריפטיקאז, צלחות אגר דם סויה (TSA II עם 5% דם כבשים). לעטוף צלחות parafilm ולאחסן ב 37 ° C באינקובטור אנאירובי במשך 4-7 ימים.
4. חסן P. gingivalis לתוך 3 מ"ל עירוי לב המוח (BHI) מרק בתוספת hemin ו menadione, מדיה נוזלית מועשר לא סלקטיבית לבידוד ותרבית של מיקרואורגניזמים אנאירוביים ו fastidious, באמצעות לולאות סטריליות.
   הערה: לאחסון לטווח ארוך, ערבבו תרביות חיידקים שהוכנו ב-BHI עם גליצרול או DMSO (ריכוז סופי של 10-20%) והכניסו למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
5. הכינו תרבית ראשונית של P. gingivalis על ידי ביצוע דילול 1:10 ולאפשר לחיידקים לגדול עד לשלב אמצע הלוג.

הערה: נקבעת הצפיפות האופטית של תרחיף החיידקים ומותאם ריכוז החיידקים לכל זן שייבדק. עבור P. gingivalis מתלה ב OD₆₆₀ של 0.7 מתאים לשלב אמצע לוג ~ 7 x 10⁸ תאים / ml. תנאי הגידול המתוארים בפרוטוקול לעיל הם ספציפיים עבור P. gingivalis וייתכן שיהיה צורך להתאים אותם לזני חיידקים אחרים.

3. תרבית תאי אנדותל

הערה: רכוש HUVECs ראשוניים מאוגדים ותרבית בתווך בסיסי המכיל גורמי גדילה אנדותל וסקולריים (VEGF) ב 37 ° C ב 5% CO₂ על פי הוראות היצרן.

1. זרעים HUVECs ב T-75 צלוחיות ב 2.5 x 10⁵ תאים / בקבוק ב 15 מ"ל VEGF מדיה.
   הערה: בדוק את הכדאיות באמצעות דילול 1:1 עם 4.0% טריפאן כחול. תאים עם קרום פגוע ישמרו על כחול טריפאן, ותאים בריאים עם קרומים שלמים ייראו לבנים כאשר מסתכלים תחת מיקרוסקופ אור דו-עיני. ספרו 100 תאים, וודאו שיותר מ-80% מהתאים הם בני קיימא.
2. יש להחליף את המדיה כל יומיים במצעי VEGF טריים שחוממו מראש עד שהתאים יגיעו למפגש ~80%.
3. יש לשטוף תאים פעם אחת במי מלח חומצים פוספט שחומם מראש (PBS). שחררו תאים מבקבוק T75 על ידי דגירה עם 2 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%) למשך 5 דקות ולאחר מכן 2 מ"ל טריפסין מנטרל פתרון.
4. לאסוף HUVECs מרחף בצינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את כל התאים הנוספים מ T-75 צלוחיות עם PBS ולהעביר צינורות חרוטי 50 מ"ל.
5. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות.
6. הסר supernatant, והשהה את גלולת התא ב 10 מ"ל מדיה VEGF שחוממה מראש.
7. קבע את ריכוז התאים באמצעות המוציטומטר או מכשיר ספירת תאים דומה.
8. חשב את כמות מתלי התא שיש להוסיף לצלחת 6 בארות (400,000 / באר) או צלחת 12 בארות עם כיסויים (50,000 / באר). HUVECs יהיו מוכנים לניסויים למחרת.

4. מבחן הישרדות פלישה/אינטראקציה (ציפוי)

הערה: בעת ביצוע בדיקה זו, הכינו שתי צלחות 6 בארות של תאי אנדותל שנזרעו ב-400,000 תאים/באר. צלחת אחת תשמש להערכת חיידקים המחוברים לתאים מארחים ומופנמים על ידם. הצלחת השנייה תסביר חיידקים תוך תאיים. צלחת 6 בארות מאפשרת לבצע טריפליקטים של שתי דגימות בניסוי אחד. לקבלת תיאור של פרוטוקול זה, עיין בתרשים הזרימה של בדיקת ההישרדות (איור 2).

1. הכינו חיידקים אנאירוביים כמתואר לעיל (ראה סעיף 1) עד שהם מגיעים לצמיחה באמצע היומן (OD₆₆₀ 0.5-0.7).
2. חיידקי צנטריפוגות ב 5,000 x גרם למשך 10 דקות.
   הערה: אם הצנטריפוגה נמצאת מחוץ לתא אנאירובי, יש לשאת דגימות חיידקים בצינור אטום היטב של 15 מ"ל, ולעטוף את הפקק בפרפילם כדי למנוע דליפת חמצן.
3. מניחים את P. gingivalis בחזרה בחדר, ומשליכים supernatant. יש לשטוף שוב עם PBS, וחיידקים כדוריים לפני השעיה מחדש במדיה VEGF. הכינו מתלים לכל זני החיידקים שייבדקו ב-OD₆₆₀ של 0.7, המתאים לשלב אמצע הלוג (~7 x 10,⁸ תאים/מ"ל). החיידק מוכן כעת לזיהום.
4. מעבירים צלחות 6 בארות המכילות HUVECs מאינקובטור תרבית הרקמה לתוך התא האנאירובי. יש להסיר את המדיה ולשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. הוסף 2 מ"ל של מדיה אנאירובית VEGF לכל באר ומניחים את הצלחות ב 37 ° C באינקובטור אנאירובי במשך 20 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה עבור זיהום.
   הערה: חיידקי צלחת על צלחות אגר דם כדי להבטיח את אלה המשמשים לזיהום הם הומוגניים ולא מזוהמים עם זיהום.
5. להדביק תאים מארחים בחיידקים בריבוי זיהומים (חיידקי MOI: מארח) של 100:1.
   הערה: מספר תאי HUVEC נקבע על ידי ביצוע בדיקת אי הכללת טריפאן על באר אחת לפני ההדבקה. מספר תאי החיידק נקבע באמצעות צפיפות אופטית (למשל, OD של 0.5 = 5 x 10⁸ תאים / מ"ל). ריכוז החיידקים מותאם ל-MOI תקין בהתבסס על ריכוז HUVEC.
6. הכניסו צלחות 6 בארות עם HUVECs נגועים לתוך האינקובטור האנאירובי ואפשרו לחיידקים לתקשר עם תאים מארחים במשך 30 דקות.
7. הכינו סאפונין ב-BHI (1.0% w/v) בתוך התא האנאירובי וסננו דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
8. הישרדות של חיידקים מחוברים ומופנמים כאחד.
   1. מוציאים צלחות מהאינקובטור, שואפים מדיה, שוטפים שלוש פעמים עם PBS אנאירובי ומוסיפים 2 מ"ל מסונן 1.0% סאפונין (מוכן כמתואר בשלב 4.8). יש לדגור במשך 15 דקות כדי לאפשר ליזה של תאים מארחים.
   2. לגרד את החלק התחתון של כל באר עם מגרד תאים. אספו את תערובת התאים מכל באר ובצעו דילול של 1:1 ב-BHI.
   3. המשך לבצע דילולים סדרתיים של המדגם. בהתאם למיני החיידקים ולריכוזם, התאימו את הדילולים הסדרתיים. התחל עם דילולים של 1:100 או 1:1,000.
   4. צלחת 200 מיקרוליטר של דילול רצוי על צלחות אגר דם. עוטפים את הצלחות בפרפילם ומניחים אותם באינקובטור האנאירובי ב 37 מעלות צלזיוס.
   5. לאחר שבעה ימי דגירה בטמפרטורה של 37°C, הסר את הלוחות וספור יחידות יוצרות מושבות (CFUs) באמצעות תיבת אור כדי לספור מושבות באופן ידני.
      הערה: CFUs נספרים. עבור כמויות גדולות יותר של CFUs, ניתן לצלם תמונות ולהשתמש בתוכנת מחשב כדי להקל על ספירת CFUs.

תוצאות

איור 1. תא ויניל אנאירובי ומרכיביו. (A) תא ויניל אנאירובי אטום לחלוטין מחמצן אטמוספרי מספק מרחב עבודה לשני אנשים בכל פעם (32 אינץ' x 78 אינץ'). הוא מכיל אינקובטור להגדיר ב 37 ° C (אמצע אחורי). (B) מנעול אוויר משמש להעברת פריטים מסביבת המעבדה לתא האנאירובי. בתמונה נראה נעילת אוויר אוטומטית המופעלת באמצעות בקר שניתן לתכנת לביצוע אוטומטי של הליכי ואקום וטיהור הדרושים לי...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ויניל אנאירובי סוג B	מוצרי Coy Laboratory		חממת מודל 2000
TSA II טריפטיקז סויה אגר עם 5% דם כבשים	BBL	221261
וריד טבורי אנושי תאי אנדותל מאגר 10 תורמים	טכנולוגיית LifeLine	FC-0044
ערכת VascuLife VEGF Medium Complete	טכנולוגיית LifeLine	LL-0003
טריפקיט	קו חיים	LL-0013
ספונין	רידל-דה האן	16109