$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הפנמת חיידקים לתאים מארחים (מיקרוסקופ פלואורסצנטי)
הערה: P. gingivalis מסומן עם 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl Ester (BCECF-AM). BCECF-AM הוא צבע שאינו חדיר לקרום פלואורסצנטי; הפיכתו ל-BCECF פלואורסצאין באמצעות פעולה של אסטראזות תוך-תאיות יכולה להצביע על כדאיות התא. P. gingivalis מסומן בצבע BCECF-AM ולאחר מכן משמש להדבקת תאים אאוקריוטים. לאחר ההדבקה, התאים קבועים ומסומנים עם DAPI ו- TRITC-phalloidin. כתם DAPI המשמש להכתמת גרעין התא האיקריוטי יסמן גם את גרעין התא החיידקי, המספק אמצעי נגד לזיהוי חיידקים שאינם בני קיימא שאינם יכולים לבקע מטבולית BCECF-AM. תאי המאכסן מודגשים באמצעות TRITC-phalloidin, צבע אקטין אדום.
- כיסויי אוטוקלאב. יש להוסיף כיסויים לצלחות של 12 בארות לפני זריעת תאי אנדותל בגודל 5X104 תאים/באר. (הוכן יום לפני הניסוי)
- הכינו תאי אנדותל על כיסויים עגולים בקוטר 18 מ"מ (#1.5 עובי) בצלחות 12 בארות כמתואר לעיל.
- הכינו חיידקים אנאירוביים שגדלו עד לשלב אמצע היומן (OD660 = 0.5-0.7).
- לשטוף חיידקים 2x עם PBS אנאירובי על ידי צנטריפוגה ב 5,000 x גרם והשעיית הגלולה ב PBS ב 5-7 x 108 תאים / ml.
- הוסף 20 μl של 0.2 mM BCECF-AM ל 2 מ"ל של תרחיף חיידקי (5-7 x 108 תאים / מ"ל) לריכוז סופי של BCECF-AM של 2 מיקרומטר.
- יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות בחושך.
- לוחות העברה עם תאי אנדותל שנזרעו על 18 מ"מ (#1.5 עובי) כיסויים עגולים מחליקים מאינקובטור תרבית רקמות לתוך התא האנאירובי. לשטוף עם PBS ולהחליף עם מדיה אנאירובית VEGF.
הערה: ודא כי HUVECs בריאים תחת מיקרוסקופ אור. HUVECS צריך להיות ~ 80% confluent, מורפולוגיה צריך להיות דומה ליצרנים.
- צנטריפוגה מסומנת חיידקים ב 5,000 x גרם במשך 10 דקות כדי להסיר שאריות צבע BCECF-AM. להשהות במדיה VEGF אנאירובית של 2 מ"ל.
- להדביק תאים מארחים עם חיידקים מסומנים ב MOI של 100: 1 (חיידקים: מארח).
- יש לדגור בתא אנאירובי בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- לאחר ההדבקה יש לשטוף תאים עם PBS שלוש פעמים ולקבע ב-4.0% פרפורמלדהיד טרי למשך 10 דקות.
הערה: לאחר קיבוע תאים, ניתן לערוך ניסויים מחוץ לתא האנאירובי.
- יש לשטוף את החלקות עם PBS שלוש פעמים.
- מוסיפים 1 מ"ל של 0.2% Triton X-100 למשך 10 דקות.
- יש לשטוף את החלקות עם PBS שלוש פעמים.
- יש להוסיף 50 מיקרוליטר של TRITC phalloidin (50 מק"ג/מ"ל) לכיסויים למשך 45 דקות.
- יש לשטוף את הכיסויים שלוש פעמים, להסיר מהצלחת בעלת 12 הבארות ולהניח על שקופית עם אמצעי הרכבה רך המכיל DAPI. אטמו את הצדדים בלק.
הערה: שקופיות עשויות להיות מאוחסנות במשך כמה חודשים בחושך. יש להימנע מחשיפה לאור כדי למנוע הלבנת תמונות.
- הצגת שקופיות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי.
- כאן, השתמש במערכת ספקטרלית של 34 ערוצים (גלאי מערך של 32 ערוצים וגלאי PMT צדדיים, בתוספת גלאי אור משודר) המוגדרת סביב מעמד AxioObserver (הפוך) עם שלב XY ממונע. למערכת חמישה לייזרים: דיודה כחולה (405 ננומטר), ארגון רב-קווי (458, 488, 514 ננומטר), דיודה ירוקה (561 ננומטר), HeNe אדום (633 ננומטר) ולייזר פועם 440 ננומטר. צייד מערכת Fluorescence Lifetime Imaging בשני גלאי GaAsP היברידיים (עבור FRET-FLIM).
- זהה את הפלואורסצנטיות מ- DAPI ו- TRITC בערוץ אחד באמצעות מסנן פס כפול עם אורכי גל עירור של 340-380 ננומטר ו- 540-560 ננומטר, ומסנן פליטה של 435-485 ננומטר ו- 570-590 ננומטר בהתאמה. זהה את הפלואורסצנטיות מ- BCECF-AM באמצעות מסנן באורך גל עירור של 440-500 ננומטר ומסנן פליטה של 510-590 ננומטר.
הערה: יש לבצע בקרות עבור BCECF-AM על כל זן חיידקי שנחקר כדי להבטיח תיוג נאות של חיידקים בני קיימא. ראשית, ודאו שחיידקים שאינם בני קיימא הם חיוביים ל-DAPI ול-BCECF שליליים. שנית, ודאו שחיידקים חיים יכולים לעכל BCECF-AM ל-BCECF פלואורסצאין. ייתכן שיהיה צורך לבדוק ריכוזים משתנים של החיידק או של צבע BCECF-AM לתיוג מיטבי.