הערכת פעילות הרג אופסונופאגוציטית נגד פתוגנים חיידקיים

תקציר

מקור: Paschall, A. V. et al., Opsonophagocytic Killing Assay כדי להעריך תגובות אימונולוגיות נגד פתוגנים חיידקיים.J. Vis. Exp.(2019)

הסרטון מראה בדיקת הרג אופסונופאגוציטית במבחנה באמצעות תרבית משותפת של נויטרופילים אנושיים עם דלקת ריאות סטרפטוקוקוס. נוגדנים וחלבונים משלימים מאפשרים אופסוניזציה של החיידקים, ומאפשרים לנויטרופילים לזהות ולהרוג חיידקים, ומראים פעילות אופסונופאגוציטית מוצלחת של נויטרופילים.

פרוטוקול

1. תרבית, התמיינות ואימות של תאי HL-60

1. הכינו מדיה של תרבית תאים HL-60 המורכבת מ-500 מ"ל Roswell Park Memorial Institute (RPMI) עם L-גלוטמין וסרום בקר עוברי 50 מ"ל מומת חום. אין להוסיף אנטיביוטיקה מכיוון שהדבר עלול להשפיע על התמיינות תאי HL-60.
2. להתרבות/תחזוקה של תאי HL-60, תרבית 5 x 10⁶ תאים ב-10 מ"ל של תרבית תאים HL-60 ב-75 ס"מ,² צלוחיות מאווררות ב-37°C ו-5% פחמן דו-חמצני (CO₂). תאי מעבר כל 3-4 ימים כדי לשמור על ריכוזי תאים אופטימליים.
   הערה: ריכוז התא לא יעלה על 5 x 10⁶/מ"ל.
3. צור מלאי פעיל של תאי HL-60 על ידי ציטוט של כ 1 x 10⁶ תאים / מ"ל במדיה תרבית HL60 עם 10% dimethyl sulfoxide (DMSO) לתוך 1 מ"ל צינורות קריוגניים.
   הערה: מלאי עבודה עשוי להיות מאוחסן ב -80 °C. המלאי הראשי צריך להיות מאוחסן ב -120 °C.
4. התמיין בתאי HL-60 על-ידי תרבית של 1.5 x 10⁷ תאים ב-15 מ"ל של תרבית תאים HL-60 עם 0.6% N, N-dimethylformamide (DMF) ב-37°C ו-5% CO₂ ב-75 ס"מ סטרילי מכוסה מסנן² צלוחיות במשך 3 ימים לפני פעילות הרג אופסונופאגוציטית (OPKA).
5. ודא שתאי HL-60 התמינו בהצלחה ומתאימים לשימוש בבדיקת OPKA על ידי בדיקת הכדאיות וסמני פני השטח של התא בהתאם לפרוטוקולי ציטומטריית זרימה מבוססים. לאחר ההתמיינות, יש לקצור תאי HL-60 ולהכתים כ-1 x 10⁴ תאים עם נוגדנים/כתמים מצומדים פלואורסצנטית עבור CD71, CD35, annexin V ו-propidium iodide.
   הערה: תאים ממוינים צריכים להיות ≥65% בני קיימא, ≥55% CD35⁺ ו-≤20% CD71⁺ כפי שנקבע באמצעות פרוטוקולי אימות מבוססים (איור 1).

2. הכנת מאגרי OPKA וריאגנטים

1. הכן 50 מ"ל של חיץ אופסוניזציה סטרילי B (OBB) על ידי ערבוב 42.5 מ"ל של מלח סטרילי 1x פוספט חוצץ (PBS) עם Ca²⁺/Mg²⁺, 5 מ"ל של סרום בקר עוברי מומת חום, ו 2.5 מ"ל של 0.1% ג'לטין סטרילי. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. להשיג ארנב התינוק להשלים ולאחסן ב -80 ° C.
3. להשיג או להכין צלחות תרבית חיידקים (כלומר, 15 x 100 מ"מ² 5% צלחות אגר דם כבשים).

3. הכנת דגימות מלאי חיידקים

1. השג מלאי של זני החיידקים לבדיקה.
   הערה: עבור פרוטוקול זה, סרוטיפ 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, מסופק בנדיבות על ידי ד"ר מון נאהם) משמש.
2. גדלו את זן החיידקים בציר מתאים (כלומר, ציר טוד-יואיט + תמצית שמרים 0.5% לזן WU2 זה) למשך כ-2-4 שעות בטמפרטורה של 37°C.
   הערה: הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר (OD₆₀₀) של התרבית צריכה להיות בין 0.6 ל- 0.8.
3. משחררים את החיידקים בצנטריפוגה בטמפרטורה של 6,000 x גרם למשך 2 דקות ומרחפים מחדש את התאים ב-10-30 מ"ל של 15% גליצרול בציר המתאים. Aliquot את תרבית החיידקים (500 μL לכל aliquot) לתוך צינורות צנטריפוגות סטריליים 1.5 מ"ל ולאחסן ב -80 ° C.
4. הפשירו בקבוקון אחד של מלאי חיידקים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס. גלול את תאי החיידק והשהה מחדש ב 500 μL של OBB בתנאים סטריליים.
5. הכינו דילולים שונים של מלאי החיידקים ב-OBB (כלומר, 10 מיקרוליטר ללא דילול, 10 מיקרוליטר של 1:10, 10 מיקרוליטר של 1:100 וכו'). בצע את בדיקת OPKA (סעיפים 4-6, כולל תרבית משותפת HL-60/complement) כמתואר להלן באמצעות דילולים שונים של מלאי החיידקים שלא טופלו. תרבית את הצלחות לילה ב 30 ° C (ללא CO₂).
   הערה: הטמפרטורה של 30 °C היא ספציפית עבור WU2 כדי למנוע צמיחת יתר; זנים/סרוטיפים אחרים עשויים לגדול בצורה אופטימלית ב-37°C.
6. ספרו את המושבות עבור כל דילול של מלאי חיידקים לא מטופל בתרבית משותפת עם תאי HL-60 והשלימו. לקבוע איזה דילול של חיידקים מניב את המספר האופטימלי של מושבות הניתנות לספירה (כ-80-120 יחידות יוצרות מושבה (CFUs) עבור חיידקים לא מטופלים שעברו תרבית משותפת עם תאי HL-60). שימו לב לדילול זה עבור OPKA עתידיים הכוללים את מלאי החיידקים הזה.

4. טיפול בחיידקים ותרבית

1. הפשירו צינור אחד של מלאי חיידקים שהוכן בשלב 3.3. חיידקי גלולה (6,000 x גרם למשך 2 דקות) ולהשהות מחדש את גלולת התא ב- OBB בדילול אופטימלי כפי שנקבע בשלב 3.6.
2. פיפטה 10 μL של דילול חיידקים מרחף לכל באר בצלחת תרבית תאים עגולה 96 באר.
3. הוסף 20 μL של נוגדנים מתאימים או טיפול תרופתי לכל באר ניסיונית ב- duplicate.
   הערה: בפרוטוקול זה, נוגדן ספציפי לסרוטיפ שנוצר בעכברים מתווסף כטיפול X, ואנזים הידרולאז גליקוזיד הידוע כמפרק את הקפסולה הרב-סוכרית סרוטיפ 3 מתווסף כטיפול Y (איור 2). עבור בארות בקרה, השתמש 1x PBS או OBB, בהתאם למאגר המשמש לבארות טיפול.
4. נערו את צלחת הדגימה במהירות של כ-90 סל"ד למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. התאימו תנאים אלה בהתאם לטמפרטורה האופטימלית או לתנאי הרעידה של הטיפולים הנבדקים.

5. תרבית חיידקית HL-60

1. הכן תאי HL-60 על ידי קצירת התאים המתמיינים HL-60 המטופלים ב- DMF שלושה ימים לפני (ראה שלב 1.4) לתוך צינורות חרוטיים של 15 מ"ל. גלול את התאים (500 x גרם, 3 דקות), להשליך את supernatant, ולשטוף עם לפחות 10 מ"ל של 1x PBS.
2. גלול את התאים שטופים (500 x גרם, 3 דקות), להשליך את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים ב OBB (להתחיל עם 1 מ"ל OBB ולהתאים לריכוז סופי של 1 x 10⁷/מ"ל לאחר ספירת תאים).
3. הוסף משלים ארנב התינוק (סרום ארנב תינוק סטרילי, לא מדולל, גיל 3-4 שבועות) בנפח סופי 1:5.
   הערה: הריכוז הסופי של תערובת המשלים HL-60 צריך להיות 1 x 10⁷/mL. אם בודקים תלות משלימה, ניתן להשתמש בתמיסה שנייה המכילה תאי HL-60 פעילים עם משלים מומתים בחום (ניתן להשבית את המשלים על ידי דגירה באמבט מים בטמפרטורה של >55 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות).
4. לאחר השלמת תרבית חיידקים של שעה אחת (שלב 4.4), חלקו כל דגימה (כלומר, 10 מיקרוליטר מכל דגימה של 30 מיקרוליטר לשתי בארות חדשות) לבארות כפולות עבור שתי קבוצות (כלומר, השתמשו רק ב-20 מיקרוליטר מהתרבית המשותפת המקורית של 30 מיקרוליטר כדי להסביר את טעות הפיפט): קבוצה אחת תורכב בתרבית משותפת עם משלים HL-60 וקבוצה אחת תכלול חיידקים בלבד. הוסף 50 μL של תערובת המשלים HL-60 (משלב 5.3) לכל קבוצה ניסיונית של בארות (מואצלת +HL-60); הוסף 50 μL של OBB בלבד לבארות של חיידקים בלבד (מוסמך -HL-60).
   הערה: עבור דוגמה זו, כ-800 יחידות CFUs חיידקיות משמשות לתרבית משותפת ראשונית עם 5 x 10⁵/50 μL HL-60 cells. אם ריבוי זה של זיהום גבוה מדי או נמוך מדי כפי שמצוין על ידי מספרי המושבה הסופיים, התאם את דילול החיידקים הראשוני בניגוד לספירת התאים HL-60.
5. נערו את הצלחת בעלת 96 הבארות בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת (ללא CO₂).

6. ציפוי לדוגמה ודגירה לילה

1. לדלל כל באר 1: 5 עם OBB, כך שכל דגימה יש נפח של לפחות 50 μL.
2. פיפטה 50 μL של כל דגימה ישירות על אזור ייעודי של צלחת תרבית חיידקים, הבטחת מרווח הולם בין דגימות. עבור 15 x 100 מ"מ² לוחות אגר עגולים, מזלפים כ 4 דוגמאות על צלחת אחת.
3. מכסים ומניחים לדגימות להתייבש במשך כ-15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הפוך צלחות ותרבות לילה ב 30 ° C (ללא CO₂). לחלופין, צלחות תרבית בצנצנות אנאירוביות כדי לבדוק אם תנאים אנוקסיים משפיעים על גדילת חיידקים או כדי לשלוט במורפולוגיה.
5. לאחר תרבית לילה, ספרו את המושבות בכל אזור מדגם ייעודי. נתח נתונים על-ידי השוואת מספר התאים החיים בכל קבוצה לבקרות ו/או לדגימות המתאימות שאינן מקבלות תרבית משותפת של תאי HL-60 (דבר המעיד על 100% הישרדות תאים, 0% הרג תאים).

תוצאות

איור 1: אימות התמיינות תאי HL-60 באמצעות ציטומטריית זרימה.תאי HL-60 ממוינים נקצרו, נשטפו והושעו מחדש ב-1 x 10⁵ תאים/מ"ל PBS. לאחר מכן חולקו התאים ל-12 בארות (100 מיקרוליטר/באר) בצלחת בת 96 בארות. התאים הוכתמו אז באנטי-CD35 מצומד פלואורסצנטית, אנטי-CD71, אנקסין V ופרופידיום יודיד. תאים לא מוכתמים או תאים מוכתמים בנוגדנים איזוטיפיים מצומדים פלואורסצנטית שימשו כבקרות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נספח V (נגמ"ש מצומד)	ביולג'נד	640919
אנטי-CD35, אנושי (PE מצומד)	ביולג'נד	333405
אנטי-CD71, אנושי (PE מצומד)	ביולג'נד	334105
זן חיידקי לשימוש (כלומר, Streptococcus pneumoniae, WU2)	מעבדת ייחוס נשימתית חיידקית (ד"ר מון נאהם)
צלחות אגר דם	הארדי דיאגנוסטיק	A10
סרום שיבוט עוברי	הייקלון	SH30080.03
גליצרול	סיגמא	G9012-1L
תאי HL-60	ATCC	CCL-240
בקרת איזוטיפ IgG (PE מצומד)	ביולג'נד	400907
N,N-דימתילפורממיד (DMF)	פישר כימיקלים	UN2265
פרופידיום יודיד	סיגמא	P4864
מדיית RPMI עם L-גלוטמין	קורנינג	10-040-CV