מאמר שיטה

הערכת Porphyromonas gingivalis מופנמת בתאי אנדותל מארחים

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis כאורגניזם מודל להערכת אינטראקציה של חיידקים אנאירוביים עם תאים מארחים. J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה להערכת הישרדות Porphyromonas gingivalis בתוך תאי אנדותל אנושיים. מדד ההישרדות והצמיחה של Porphyromonas gingivalis מופנם מוערך על ידי מספר המושבות על צלחת אגר הדם.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הישרדות חיידקים מופנמים.

  1. הכינו חיידקים אנאירוביים של P. gingivalis עד שהם מגיעים לצמיחה באמצע היומן (OD660 0.5-0.7).
  2. חיידקי צנטריפוגות ב 5,000 x גרם למשך 10 דקות.
  3. מניחים את P. gingivalis בחזרה בתא, ומשליכים את supernatant. יש לשטוף שוב עם PBS, וחיידקים כדוריים לפני השעיה מחדש במדיה VEGF. הכינו מתלים לכל זני החיידקים שייבדקו ב-OD660 של 0.7, המתאים לשלב אמצע הלוג (~7 x 10,8 תאים/מ"ל). החיידק מוכן כעת לזיהום.
  4. מעבירים צלחות 6 בארות המכילות HUVECs מאינקובטור תרבית הרקמה לתוך התא האנאירובי. יש להסיר את המדיה ולשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי. הוסף 2 מ"ל של מדיה אנאירובית VEGF לכל באר ומניחים את הצלחות ב 37 ° C באינקובטור אנאירובי במשך 20 דקות כדי לאזן את הטמפרטורה לזיהום.
  5. להדביק תאים מארחים בחיידקים בריבוי זיהומים (חיידקי MOI: מארח) של 100:1.
    הערה: מספר תאי HUVEC נקבע על ידי ביצוע בדיקת אי הכללת טריפאן על באר אחת לפני ההדבקה. מספר תאי החיידק נקבע באמצעות צפיפות אופטית (למשל, OD של 0.5 = 5 x 108 תאים / מ"ל). ריכוז החיידקים מותאם ל-MOI תקין בהתבסס על ריכוז HUVEC.
  6. הכניסו צלחות בנות 6 בארות עם HUVECs נגועים לאינקובטור אנאירובי ואפשרו לחיידקים לתקשר עם תאים מארחים במשך 30 דקות.
  7. הכינו סאפונין ב-BHI (1.0% w/v) בתוך התא האנאירובי וסננו דרך מסנן של 0.2 מיקרומטר.
  8. מוציאים צלחות מהאינקובטור. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אנאירובי ולהוסיף 2 מ"ל VEGF מדיה עם תוספת אנטיביוטיקה (300 מיקרוגרם / מ"ל של גנטמיצין ו 400 מיקרוגרם / מ"ל של metronidazole).
  9. יש לדגור במשך שעה. הקפידו לבדוק את האנטיביוטיקות כך שיהיו יעילות ב-100% בהריגת זן החיידקים הרצוי וודאו שהן אינן חודרות לתאי המאכסן.
  10. לשאוף מדיה, להוסיף 2 מ"ל של מסונן 1.0% saponin. יש לדגור במשך 15 דקות כדי לאפשר ליזה של תאים מארחים.
  11. לגרד את החלק התחתון של כל באר עם מגרד תאים. אספו את תערובת התאים מכל באר ובצעו דילול של 1:1 ב-BHI.
  12. הכינו דילולים סדרתיים של הדגימה (1:100, 1:1,000).
  13. צלחת 200 מיקרוליטר של דילול רצוי על צלחות אגר דם. עוטפים צלחות בפרפילם ומניחים אותן באינקובטור אנאירובי.
  14. לאחר שבעה ימים של דגירה ב 37 מעלות צלזיוס להסיר צלחות ולספור CFUs.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ויניל אנאירובי סוג Bמוצרי Coy Laboratoryחממת מודל 2000
TSA II טריפטיקז סויה אגר עם 5% דם כבשיםBBL221261
וריד טבורי אנושי תאי אנדותל מאגר 10 תורמיםטכנולוגיית LifeLineFC-0044
ערכת VascuLife VEGF Medium Completeטכנולוגיית LifeLineLL-0003
טריפקיטקו חייםLL-0013
ספוניןרידל-דה האן16109
מלח גנטמיצין סולפטסיגמא-אולדריץ'G-1264
מטרונידזולסיגמא-אולדריץ'M-3761

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

VEGFHUVEC

מאמרים קשורים