כל הנהלים הנוגעים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ועל ידי ועדת הבדיקה הווטרינרית JoVE.
1. ביטוי וטיהור נוגדנים
- תחזוקת תאי שחלה של אוגר סיני (CHO)
- לגדל תאי CHO ב-FreeStyle CHO Media בתוספת תוסף גלוטמין 1x זמין מסחרית ב-37°C, ניעור ב-130 סל"ד עם 5% CO2 באמצעות צלוחיות Erlenmeyer דה-לונג, זכוכית או חד פעמיות.
הערה: מומלץ מאוד להשתמש בבקבוק מבולבל עם פקק מאוורר להגברת התסיסה ולשיפור העברת הגזים בתנאי רעידה. תפוקת נוגדנים מופחתת משמעותית הושגה עם צלוחיות רגילות (לא מבולבלות) עקב תסיסה מוגבלת של תרבית התרחיף.
- שמור על מספר התא בין 1-5 x 106 תאים/מ"ל עם >95% כדאיות התא. אם מספר התא גדל מעל 5 x 106 תאים/מ"ל, פצל את התאים. לעולם אל תאפשר לתאי CHO להגיע מתחת ל 0.2 x 106 תאים / מ"ל.
- טרנספקציה של תאי CHO
- לגדל תאי CHO ב 200 מ"ל של מדיה (2 x 106 תאים / מ"ל) ב צלוחיות מבולבלות Erlenmeyer.
הערה: תרביות תרחיף שגדלו בצלוחיות מבולבלות תמיד הניבו תפוקת חלבון גבוהה יותר בהשוואה לגידול בצלוחיות לא מבולבלות.
- בשפופרת של 15 מ"ל, קח 5 מ"ל של מדיה בסגנון חופשי CHO והוסף 50 מיקרוגרם של DNA משובט VH ו- 75 מיקרוגרם של DNA משובט VL. מערבולת לערבב היטב.
- לדגור על תערובת הדנ"א בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות
הערה: דגירה ארוכה יותר מפחיתה את תפוקת החלבון.
- הוסף 750 μL של 1 מ"ג / מ"ל פוליאתילנימין (PEI) ציר לתמיסת ה- DNA ומערבל באגרסיביות את התערובת במשך 30 שניות. לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות נוספות < br / >
הערה: PEI חייב להיות טרי. מחזורי הקפאה-הפשרה מרובים של PEI מפחיתים את התשואה הכוללת באופן משמעותי.
- הוסף את כל תערובת ה- DNA וה- PEI לתאים תוך ניעור ידני של הצלוחית. מיד לדגור את צלוחיות ארלנמאייר מבולבל עם תאים ב 37 ° C רועד ב 130 סל"ד.
- Expression
הערה: לנוגדן יש פפטיד אות הפרשה המהונדס לקצה N-terminal שלו, המסייע לנוגדנים להיות מופרשים החוצה לתקשורת.
- לגדל את התאים הנגועים ב 37 ° C, עם רעד ב 130 סל"ד ביום 1.
- ביום השני, יש להוסיף 2 מ"ל של 100x חומר נוגד גושים ו-2 מ"ל של 100x תמיסה אנטי-בקטריאלית-אנטי-מיקוטית. מעבירים את הבקבוק לטמפרטורה נמוכה יותר (32-34 מעלות צלזיוס), עם רעד ב-130 סל"ד.
- בכל יום חמישי, הוסף 10 מ"ל של הזנת טריפטון N1, ו -2 מ"ל של תוסף גלוטמין 100x.
- המשך לספור את התאים כל יום שלישי באמצעות hemocytometer לאחר צביעת aliquot של תאים עם כתם כחול trypan. ודא שיכולת הקיום של התא נשארת מעל 80%.
- ביום 10 או 11, קצרו את המדיום לטיהור נוגדנים. סובב את התרבית במהירות של 3000 x גרם, 4 ° C למשך 40-60 דקות ולאחר מכן סנן את המדיה השקופה באמצעות מסנני בקבוקים של 0.22 מיקרומטר.
- טיהור
הערה: טיהור נוגדנים מתבצע באמצעות עמודת Protein-A זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים), באמצעות משאבה פריסטלטית.
- אזן את העמודה עם נפח שתי עמודות של מאגר קשירה (20 mM נתרן פוספט ב- pH 7.4).
- מעבירים את המדיה המסוננת המכילה נוגדן (המתקבל בשלב 1.3.5) דרך העמודה בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.
- שטף את העמודה בנפח של שתי עמודות של מאגר כריכה.
- יש להצמיד את הנוגדן לשברים של 500 מיקרוליטר באמצעות מאגר אלוציה של 5 מ"ל (30 מ"מ נתרן אצטט ב-pH 3.4).
- נטרול ה- pH של הנוגדן המדולל על ידי הוספת 10 μL של חיץ נטרול (3 M נתרן אצטט ב- pH 9) לכל שבר.
הערה: חלק מספר 3-6 מכיל את רוב הנוגדן. מומלץ לשמור את כל השברים במקרה שהנוגדן מדולל בשבר מאוחר מהצפוי.
- מדוד את ריכוז הנוגדנים המטוהרים באמצעות ספקטרופוטומטר על ידי בחירת פרוטוקול ברירת המחדל עבור אימונוגלובולין G (IgG). הריכוז הסופי של הנוגדן מתקבל במ"ג/מ"ל על ידי התחשבות במשקל המולקולרי ובמקדם הספיגה.
2. תיוג פלואורסצנטי
הערה: נוגדנים מסומנים בצבע אינפרא אדום המכיל קבוצה תגובתית אסטר NHS, אשר מזווג חלבונים ויוצר צימוד יציב. תגובה זו רגישה ל-pH ופועלת בצורה הטובה ביותר ב-pH 8.5. מצומדים פלואורסצנטיים המסומנים בצבע מציגים ספיגה מקסימלית של 774 ננומטר, ופליטה מקסימלית של 789 ננומטר. pH 8.5 הוא המפתח לצמידות יעילה.
- Dialyze 0.5 מ"ל של הנוגדן באמצעות קלטת דיאליזה (0.1-0.5 מ"ל) ב 1 L של חיץ הצמדה (50 mM חיץ פוספט ב pH 8.5). לאחר 4 שעות מעבירים את קלטת הדיאליזה לחיץ טרי ועושים דיאליזה למשך הלילה.
- הגדר תגובת צימוד על ידי הוספת 0.03 מ"ג IRDye 800CW לכל 1 מ"ג נוגדנים בנפח תגובה של 500 μL.
הערה: IRDye 800CW מומס ב-DMSO בריכוז של 10 מ"ג/מ"ל.
- בצע תגובות תיוג במשך שעתיים ב- 20 ° C.
הערה: הגדלת הזמן מעבר לשעתיים אינה משפרת את התיוג.
- לטהר את המצמידות המסומנות על ידי דיאליזה נרחבת כנגד 1x PBS.
- העריכו את מידת הסימון על ידי מדידת ספיגת הצבע ב-780 ננומטר וספיגת החלבון ב-280 ננומטר. תרומת הצבע לאות 280 ננומטר היא 3%.
- חשב את יחס הצבע/חלבון באמצעות נוסחה זו:
כאשר 0.03 הוא גורם תיקון לספיגת הצבע המשמש ב-280 ננומטר (שווה ל-3.0% מספיגתו ב-780 ננומטר), εDye ו-εProtein הם מקדמי הכחדה מולאריים עבור הצבע והחלבון (נוגדן) בהתאמה.
הערה: εDye הוא 270,000 M-1 cm-1 ו- εProtein הוא 203,000 M-1 cm-1 (עבור IgG טיפוסי) בתערובת 1:1 של PBS: מתנול. חלבונים שאינם IgG עשויים להיות בעלי מקדמי הכחדה מולאריים שונים מאוד. השימוש במקדם ההכחדה הנכון עבור החלבון המעניין חיוני לקביעה מדויקת של יחס D/P.
- חשב את ריכוז החלבון הסופי באמצעות נוסחה זו:
הערה: ודא תמיד את היעילות קושרת האנטיגן של נוגדנים מסומנים ולא מסומנים באמצעות ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) או ציטומטריית זרימה לפני שתמשיך למחקרי in vivo.
3. מחקרי קסנוגרפט עכבר
- הכנת תאי גידול להזרקה
- לגדל תאי OVCAR-3 ב RPMI-1640 בינוני, בתוספת 10% של FBS ו 1x פניצילין-סטרפטומיצין.
- יום לפני ההזרקה, תאי תת-תרבית לתוך צלחות תרבית חדשות בקוטר 100 מ"מ עם 10 מ"ל של מדיום/צלחת מלאה. השתמש במספר תא של 0.5-1 x 106 תאים/צלחת.
- לדגור על תרביות בטמפרטורה של 37°C, 95% לחות ו-5%CO2 למשך 20-24 שעות.
- ביום ההזרקה, מוציאים את מדיום הגידול מכלי התרבית. שטפו ביסודיות את שכבת התא עם מי מלח חוצצי פוספט (DPBS) ללא Ca2+/Mg2+ של Dulbecco כדי להסיר תאים מתים, פסולת תאית וכל עקבות הסרום, מה שעלול להפריע לפעולת טריפסין.
- טריפסינזציה של התאים על ידי הוספת 1.0-1.5 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA לכל צלחת ולנסות לפזר את התמיסה על ידי הטיית המנה מסביב ואחריה דגירה ב 37 ° C במשך 5-10 דקות.
הערה: התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק את מצב הטריפסיניזציה בפועל. תחת טריפסיניזציה התוצאה היא מספר נמוך יותר של תאים המתנתקים מפני השטח של צלחת התרבית, טריפסיניזציה יתר גורמת ללחץ תאי. לכן, טריפסיניזציה נכונה חשובה.
- הוסף 1.0-1.5 מ"ל של מדיום גידול מלא לכל צלחת כדי לעצור את פעולת הטריפסין, לאחר מכן להשהות מחדש תאים על ידי pipetting בעדינות.
הערה: פיפטינג עדין חשוב לשמירה על בריאות התא.
- אסוף את מתלה התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וסחרור ב 250 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאסוף את גלולת התא לאחר הסרת supernatant ולשטוף את התאים על ידי השעיה מחדש של הגלולה ב 1x DPBS.
- סובב את מתלה התא במהירות נמוכה של 250 x גרם למשך 5 דקות.
- הוסף 500 μL של DPBS והשהה מחדש תאים על ידי פיפטינג עדין כדי לקבל השעיה של תא יחיד.
- ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מונה תאים אוטומטי.
הערה: לקבלת דיוק טוב יותר, חזור על הספירה שלוש פעמים וקח ממוצע.
- התאם את עוצמת הקול באופן כזה שצפיפות התאים הסופית תהיה 1 x 108 תאים / מ"ל.
- הזרקה תת עורית של תאים לפיתוח xenografts עכבר
הערה: כל ההליכים צריכים להיעשות בארון בטיחות BSL2. עכברי Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ שימשו במחקר הנוכחי.
- קח 50 μL של תרחיף התא לתוך צינור 1.5 מ"ל וערבב עם 50 μL של מטריצת קרום מרתף medium.
הערה: מדיום מטריצת קרום מרתף נוטה ליצור מצב דמוי ג'ל בטמפרטורת החדר, לכן שמור בזהירות על התאים ועל תערובת המדיום המטריקס על קרח. מומלץ לשמור צינורות, קצוות ומזרקים במקרר ולאחר מכן להעביר אותם על קרח לפני הזרקת החי.
- יש להסעיר את התערובת כדי למנוע הצטברות תאים. לאחר מכן, קח את זה 100 μL של תערובת בינונית מטריצת תרחיף התא המכילה 5 x 106 תאים, לתוך מזרק 1 סמ"ק.
- הרימו בעדינות את עור החיה כדי להפריד את העור משכבת השריר שמתחתיה והזריקו לאט את תרחיף התאים (100 מיקרוליטר) מתחת לעור (5 x 106 תאים), עם מחט 26 גרם. המתן מספר שניות לפני הוצאת המחט, כך שתווך מטריצת המרתף יוכל ליצור את המבנה דמוי הג'ל המוצק למחצה יחד עם תאים מתחת לעור, ולמנוע מהתערובת לצאת מאתר ההזרקה.
הערה: תאים צריכים להיבדק לפני ההזרקה עבור כל זיהום שעלול לפגוע בעכברים מדוכאי חיסון. בזמן ההזרקה אין להכניס את המחט עמוק מדי לתוך העור מכיוון שהדבר עלול ליצור את הגידול עמוק מהצפוי.
- החזיקו את בעל החיים בכלוב סטרילי והתבוננו במשך כ-20 דקות.
- התבוננו בעכברים במשך 2-3 שבועות ואפשרו לגידול לגדול עד 500 מ"מבגודל 3.
4. לוקליזציה של נוגדנים באמצעות מערכת הדמיה in vivo
הערה: ציוד הדמיה In vivo (ראה טבלת חומרים) המשמש בניסוי זה משתמש בסדרה של מסננים בעלי יעילות גבוהה ואלגוריתמים ספקטרליים לביטול ערבוב לצורך הדמיה לא פולשנית ומעקב אחר פעילות תאית וגנטית בתוך אורגניזם חי בזמן אמת. המערכת מספקת הן פלואורסצנטיות והן יכולת ניטור ביולומינסנציה.
- יש להזריק 25 מיקרוגרם של נוגדן מסומן בצבע דרך וריד הזנב.
- מרדימים עכברים נושאי גידול באמצעות איזופלורן 2%. בדוק את חוסר התגובה לרפלקסים של הדוושות.
- ברגע שהעכברים מפסיקים לנוע, מרחיבים את וריד הזנב הצידי על ידי מריחת מי תולעים.
- הזריקו 25 מיקרוגרם (ב-100 מיקרוליטר) של נוגדן מסומן באמצעות מזרק אינסולין 1 סמ"ק עם מחט 26 גרם.
- באופן דומה, כבקרה שלילית, יש לתייג ולהזריק את נוגדן האיזוטיפ IgG1 הלא ספציפי שאינו מכוון לתאים סרטניים.
- בצע הדמיה חיה in vivo לאחר 8, 24, 48 שעות וכו 'של זריקות נוגדנים.
- בתוכנה המשויכת, לחץ על Initialize הממוקם בלוח הבקרה ואשר שטמפרטורת הבמה היא 37 °C.
- הפעל את אספקת החמצן, את כל המשאבות במערכת ההרדמה ואת אספקת גז האיזופלורן לתא ההרדמה, והגדר את שסתום האידוי של איזופלורן ל -2%.
- מעבירים את העכברים לחדר ההרדמה וממתינים עד שהעכברים מורדמים לחלוטין. יש למרוח את משחת סיכת העיניים כדי למנוע ייבוש בעיניים.
- עבור אל לוח הבקרה, הגדר את ההדמיה הפלואורסצנטית באמצעות האפשרות אשף ההדמיה ובחר את העירור ב- 773 ננומטר ואת הפליטה ב- 792 ננומטר.
הערה: קביעות ברירת המחדל של חשיפה אוטומטית מספקות תמונה פלואורסצנטית טובה. עם זאת, ניתן לשנות את העדפות החשיפה האוטומטית בהתאם לצרכים.
- מעבירים את העכברים המורדמים לתא ההדמיה ומרכיבים אותם בשדה ההדמיה באמצעות חרוט אף. שלב ההדמיה מספק את האפשרות להכיל 5 עכברים בכל פעם.
הערה: דאגו שעכברי הבקרה יצולמו יחד עם עכברי הבדיקה כדי לקבל כמות דומה של חשיפה והגדרות אחרות בזמן הניתוח.
- לאחר שהכל מוכן, בחר באפשרות רכישה בלוח הבקרה עבור רכישת התמונה.
- בעזרת הגדרות חשיפה אוטומטית, המערכת מפיקה את התמונה תוך דקה. התמונה הנוצרת היא שכבת העל של פלואורסצנטיות על התמונה הצילומית עם עוצמת פלואורסצנטיות אופטית המוצגת ביחידות של ספירות או פוטונים או במונחים של יעילות.
- לאחר קבלת התמונה, העבירו את העכברים מתא ההדמיה בחזרה לכלוב שלהם והתבוננו בהחלמתם במשך דקה עד שתיים.
- כוונן את התמונה עוד יותר עם הכלים והפונקציות המסופקים בתוך התוכנה לניתוח תמונה. כלי ניתוח תמונה נמצאים בשורת התפריטים ובלוח הכלים.
- באזור 'התאמת תמונה', התאימו את הבהירות, הניגודיות או האטימות ובחרו את סרגל הצבעים.
- השתמש בכלי החזר ההשקעה כדי לציין אזור עניין (ROI) בתמונה אופטית ולמדוד את עוצמת האות בתוך החזר ההשקעה. במידת הצורך, יצא את נתוני האות המכומתים לתוכנת גיליון אלקטרוני והתווה את הנתונים.
- למחקרי המשך, נתח נקרופסיות עכברים של רקמות שונות (למשל, כבד, ריאות, לב, כליות, טחול, מוח וכו ') זה לצד זה לקבלת הפצה מפורטת ולא ספציפית של נוגדנים המסומנים פלואורסצנטית.
הערה: הנתונים יכולים להיות נתמכים עוד יותר עם ELISA ספציפי לרקמות על ידי שימוש באנטיגן (FOLR1 במקרה זה) ב 96 בדיקות באר.
