מאמר שיטה

ציטומטריית זרימה צביעה של Mycobacterium tuberculosis תת-אוכלוסיות מקרופאגים נגועות

8 ביולי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: Mily, A., et al. קיטוב של M1 ו- M2 תאים שמקורם במונוציטים אנושיים וניתוח עם ציטומטריית זרימה על זיהום שחפת Mycobacterium. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מציג אסטרטגיית gating ציטומטרית של זרימה המשתמשת בלוח רב-צבעים לניתוח כדאיות התא וסמנים אנטי-אנושיים מצומדים פלואורסצנטיים ספציפיים. גישה זו מאפשרת לקבוע במדויק את אחוז אוכלוסיות התאים הנגועות בשחפת Mycobacterium.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. צביעת ציטומטריה של זרימה של תאים שמקורם במונוציטים נגועים ב-Mtb

הערה: יש לבצע את השלבים הבאים במתקן BSL-3. צביעת ציטומטריית הזרימה יכולה להתבצע בפלטת 96 בארות במקום צינורות.

  1. נתק את Mycobacterium tuberculosis, תאים נגועים ב- Mtb (ובקרות לא נגועות) מהבארות ב- 6 לוחות הקידוח על ידי דגירה עם 1 מ"ל של חיץ FACS לכל באר למשך 30 דקות לפחות ב- 37 ° C ו- 5% CO2.
  2. פיפטה בעדינות למעלה ולמטה כמה פעמים כדי להבטיח כי התאים מנותקים. במידת האפשר, לאשר ניתוק תאים עם מיקרוסקופיה. מעבירים את מתלה התא מכל באר לצינור מיקרוצנטריפוגה המכוסה בבורג ומסובבים את הצינורות במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות. יש להשליך את הסופרנאטנט בזהירות על ידי פיפטציה.
  3. שטפו את גלולת התא בכל צינור פעמיים עם חיץ FACS וסובבו את התאים במהירות של 200 x גרם במשך 5 דקות.
  4. לצבוע את התאים (בערך 0.5 x 106 עד 1 x 106 תאים / צינור) עם קוקטייל כ 50 μL של נוגדנים אנטי אנושיים מצומדים פלואורוכרום כולל TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (טבלה 1) בשילוב עם צבע קיימא Zombie-UV במשך 30 דקות ב 4 ° C (מקרר) בחושך.
  5. שטפו את התאים המוכתמים פעמיים עם 400 μL של מאגר FACS וסובבו את התאים במהירות של 200 x גרם למשך 5 דקות.
  6. תקן את התאים המוכתמים עם 200 μL של חיץ קיבוע (מוכן טרי) במשך 30 דקות ב- RT בחושך כדי להבטיח השבתה מוחלטת של מיקובקטריה.
  7. שטף את התאים פעמיים עם 400 μL של מאגר FACS וסחרור ב- 200 x גרם במשך 5 דקות כדי להסיר מאגר תיקון עודף.
  8. השהה מחדש את התאים הקבועים במאגר FACS של 400 מיקרוליטר והעבר את הדגימות לצינורות מיקרוצנטריפוגות חדשים של 1 מ"ל לפני הוצאתם ממעבדת BSL-3 לציטומטריית זרימה ב- BSL-2. אחסן את התאים המוכתמים ב +4 °C עד לקבלת הדגימה.
    הערה: רססו את הצינורות באתנול 70% לפני הוצאתם ממעבדת BSL-3. פורמלדהיד הוא רעיל (מסרטן) ויש לטפל בו בארון בטיחות ביולוגית דרגה II. השליכו פסולת פורמלדהיד לפסולת כימית נפרדת.

2. איסוף נתונים ציטומטריים של זרימה ואנליזה של תאים שמקורם במונוציטים נגועים ב-Mtb

הערה: יש לבצע שלבים 2.1–2.2 לפני צביעת ציטומטריית הזרימה המתוארת לעיל. כדי למנוע בעיות עם גושי תאים ודיסוציאציה של צבעי טנדם לאחר קיבוע תאים, רכישת דגימה של תאים נגועים ב- Mtb ושל תאים לא נגועים מתבצעת תוך 4-10 שעות לאחר צביעת נוגדנים ראשונית.

  1. לפני צביעת ציטומטריית זרימה שתוארה לעיל, פצה את האות הפלואורסצנטי עבור כל נוגדן מצומד פלואורוכרום המופיע בלוח הצביעה (טבלה 1) באמצעות חרוזי פיצוי (חיוביים ושליליים כאחד).
  2. טיטרט את דילול הנוגדנים להכתמת מקרופאגים אנושיים כדי לקבל את האות האופטימלי עבור כל פלואורוכרום.
  3. השתמש בתאים לא מוכתמים כדי לקבוע את רמת פלואורסצנטיות הרקע הנחוצה כדי לקבוע שער לאוכלוסיית התאים השלילית, המאפשר להמחיש את התאים המוכתמים (מקרופאגים הם פלואורסצנטיים אוטומטיים מאוד).
  4. רכוש לפחות 50,000 תאים/דגימה בציטומטר הזרימה באמצעות התוכנה המומלצת לרכישת נתונים.
  5. יצא את קובצי הרכישה מציטומטר הזרימה בתבנית תקן ציטומטריית זרימה (FCS) 3.1.
  6. נתח את קבצי FCS בתוכנת ניתוח ציטומטריה זרימה.
  7. שער מקרופאגים על פי מאפייני הפיזור קדימה וצידי שלהם (FSC ו- SSC) ואינו כולל תאים מתים על ידי גאט תאים חיים/מתים באמצעות צבע הכדאיות Zombie-UV.
  8. דמיינו מקרופאגים נגועים H37Rv-GFP בערוץ FITC.
  9. זהה את התדירות של תאים מוכתמים באופן חיובי ואת עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת הגיאומטרית (MFI) עבור כל הסמנים (טבלה 1).

טבלה 1: רשימת נוגדנים המשמשים לציטומטריית זרימה.

לייזרמסנןפלואורוכרוםפנוטייפפונקציהשיבוטמס' קטלוגיחברה
639670/30AF647TLR2קולטן זיהוי פתוגןTL2.1309714ביולג'נד
639780/60APC-Cy7CD206קולטן מנוז15-2321120ביולג'נד
405610/20BV605CD163קולטן נבלותגי/61333616ביולג'נד
405670/30BV650CD80מולקולה קו-סטימולטורית2D10305227ביולג'נד
405710/50BV711CCR7קולטן כימוקיןG043H7353228ביולג'נד
405780/60BV785CD86מולקולה קו-סטימולטוריתIT2.2305442ביולג'נד
488530/30GFPMtbחיידקים תוך-תאיים
561586/15PECD200Rקולטן מעכבOX-108329306ביולג'נד
561620/14PE/סנוור 594CD64קולטן גמא Fc-I של IgG10.1305032ביולג'נד
561661/20PE-Cy5 (PC5)HLA-DRמולקולת MHC Class IIL243307608ביולג'נד
355450/50BUV395צבע כדאיותסמן תא חי/מתזומבי UV423108Invitrogen

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
לא הוכרז על ניגוד עניינים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775
עז נגד עכבר IgG Alexa Fluor 594 נוגדן משניInvitrogen₪1000נוגדן משני ל- CD64
עז נגד ארנב IgG Alexa Fluor 594 נוגדן משניA-11037נוגדן משני ל- CD163
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמא-אולדריץ'F7524
EDTA (מטר 0.5בית החולים האוניברסיטאי קרולינסקה, הודינגהלא ישים
BD Comp חרוז פלוסב.ד.560497
)

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Zombie UVFACS

מאמרים קשורים