בדיקת מבחנה לחקר היכולת ציטוטוקסית של תאי הרג הנגרמים על ידי ציטוקינים

תקציר

מקור: Hsiao, C. H., et al. בידוד והרחבה של תאי T רוצחים ציטוטוקסיים הנגרמים על ידי ציטוקינים לטיפול בסרטן. J. Vis. Exp. (2020).

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה למדידת היכולת ציטוטוקסית של תאי רוצח המושרה על ידי ציטוקינים (CIK) כנגד תאים סרטניים. לאחר תרבית משותפת של תאי סרטן מטרה עם תאי CIK, תאי הסרטן המתים מזוהים באמצעות צבע כדאיות פלואורסצנטי ומכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה, האומדת את ההשפעה ציטוטוקסית של תאי CIK.

פרוטוקול

כל ההליכים המערבים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבחנו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית המקומית.

1. הכנת חומרים

1. אחסן ריאגנטים, נוגדנים וכימיקלים כפי שמוצג בגיליון נתוני בטיחות החומרים (MSDS). להמיס את התרופות או הציטוקינים בממסים כתמיסות מלאי ולאחר מכן aliquot לאחסון ב -20 ° C או -80 ° C.
   הערה: מידע מפורט להכנת החומר מצוין בטבלת החומרים.

2. בידוד תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMC)

1. חממו את תמיסת שיפוע הצפיפות (טבלת חומרים) ל-18-20°C לפני השימוש. הפכו את בקבוק התמיסה מספר פעמים כדי להבטיח ערבוב יסודי.
2. לאסוף 3-5 מ"ל של דגימת דם ורידי אדם בבקבוקון heparinized ולערבב היטב על ידי בעדינות היפוך הצינור מספר פעמים.
3. הכינו 4 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות בצינור סטרילי של 15 מ"ל.
4. בזהירות שכבה 1 מ"ל של דגימת הדם על תמיסת שיפוע הצפיפות.
5. צנטריפוגה ב 400 x גרם למשך 30 דקות ב 18-20 ° C (לכבות את ההפסקה).
6. בזהירות ומיד לשאוף את שכבת מעיל באפי של תאים מונוגרעיניים (כ 1 מ"ל) בבת אחת כדי למנוע הפרעה השכבות לצינור סטרילי 15 מ"ל באמצעות פיפטה סטרילית 1 מ"ל.
7. הוסף לפחות 3 כרכים (~ 3 מ"ל) של מלח חוצץ פוספט (PBS) לציפוי באפי בצינור הצנטריפוגה. להשהות את התאים על ידי pipeted אותם בעדינות למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילית.
8. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 10 דקות ב 18-20 ° C. לשאוף את supernatant.
9. להשעות את גלולת התא עם 5 מ"ל של מדיום בסיסי (טבלה של חומרים) ולהעביר לתוך צלוחיות. תרבית תאים באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂.

3. אינדוקציה והרחבה של CIK

1. ביום 0, תרבית את PBMCs (1 x 10⁶) בתווך בסיסי טרי המכיל 1,000 IU/mL של IFN-γ במשך 24 שעות באינקובטור תרבית תאים לח ב 37 ° C ו 5% CO₂.
2. ביום הראשון, רענן את המדיום עם מדיום בסיסי טרי המכיל 50 ng/mL של נוגדן נגד CD3, 1 ng/mL של אדם רקומביננטי (rh) IL-1α, ו 1,000 U/mL של rh IL-2. רענן את המדיום כל 3 ימים.
3. ביום השביעי, רענן את המדיום עם מדיום בסיסי טרי המכיל 1,000 U/mL של rh IL-2. רענן את המדיום כל 3 ימים עד סוף התרחבות התא (יום 14).

4. אימונופנוטיפ להערכת תאי CIK

1. לשטוף את תאי CIK עם 10 מ"ל של PBS סטרילי. צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם ו 18-20 ° C, לשאוף את supernatant, ו resuspend את התאים עם 10 מ"ל של PBS. ספור את מספר התא ובדוק את כדאיות התא באמצעות בדיקת אי ההכללה הכחולה של trypan.
2. Aliquot תאי CIK לתוך שישה צינורות סטריליים 1.5 מ"ל בצפיפות של ~ 5-10 x 10⁵ תאים / מ"ל PBS. תווית וטיפול כדלקמן: צינור 1, ריק (ללא נוגדן); צינור 2, להוסיף 20 μL של איזוטיפ IgG1-FITC; צינור 3, להוסיף 20 μL של איזוטיפ IgG1-APC mAbs; צינור 4, להוסיף 20 μL של CD3-FITC; צינור 5, להוסיף 20 μL של CD56-APC mAbs; וצינור 6, להוסיף 20 μL של CD3-FITC ו 20 μL של CD56-APC mAbs.
3. ערבבו בעדינות את תאי ה-CIK עם הנוגדנים על ידי הדבקתם בעדינות מעלה ומטה לפחות פי 3 עם פיפטה סטרילית בנפח 1 מ"ל, ולאחר מכן דגרו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
4. צנטריפוגה את הצינורות במשך 10 דקות ב 300 x גרם ו 18-20 ° C. לשאוף את supernatant ולהשעות את גלולת התא פעם אחת עם 1 מ"ל של PBS. מזלפים אותם בעדינות למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילית 1 מ"ל.
5. חזור על שלב 4.4.
6. השאירו את הצינורות בחושך לפני ניתוח ציטומטרי זרימה.

5. זיהוי סמן תקליטור

1. מעבירים את מתלה התא לצינור תחתון עגול סטרילי מפוליסטירן בנפח 5 מ"ל עם מכסה מסננת תאים (רשת של 100 מיקרומטר) על ידי פיפטוף עדין דרך הפקק. שים את הצינורות על הקרוסלה בסדר.
2. פתח את התוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה וצור תיקיית ניסוי. לחץ על הלחצן New Specimen כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי ולתת שמות לשפופרות באופן הבא: Tube 1, Blank; צינור 2, איזוטיפ IgG1-CD3; צינור 3, איזוטיפ IgG1-CD56; צינור 4, CD3; צינור 5, CD56; צינור 6, CD3CD56.
3. יצירת מערכת פיזור עבור אוכלוסיות תאי CIK (איור 1A).
   1. בחר Tube 1 (ריק) ולחץ על Dot Plot כפתור ליצירת תרשים FSC-A/SSC-A. צייר שער מלבן מעל כל אוכלוסיית התאים עם סף FSC-A >5 x 10⁴ כדי לא לכלול פסולת תאים.
   2. בחר בפרמטר SSC-A/SSC-H עבור התוויית הנקודות החדשה וצייר שער מצולע מסביב לכל התאים הבודדים. בחר בפרמטר Count/FITC (CD3) ו- Count/APC (CD56) עבור תרשים ההיסטוגרמה החדש, בהתאמה. בחר את הפרמטר FITC (CD3)/APC (CD56) עבור תרשים הנקודות החדש וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע תת-האוכלוסיות.
   3. רשום את הנתונים מ- 20,000 תאים בודדים בכל דגימה. לחץ על לחצן טען דוגמה כדי לנתח תחילה את דוגמת הפקד הריק. זהה את כל אוכלוסיית תאי CIK באמצעות הפרמטרים CD56 ו- CD3 ערוצים.
4. חזור על שלב 5.3 לחקירת כל הדגימות.
5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של הדגימה הבודדת כדי לנתח אוכלוסיות תאי CIK ולהדפיס אותם מחדש בקובצי ניתוח.

6. גידול והכתמה של תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית אנושית K562 ותאי OC-3 של סרטן השחלות

1. תאי K562
   1. תרבית תאי K562 במדיה מלאה (מדיום בסיסי RPMI המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS] ואנטיביוטיקה 50 U/mL והתאמת גלוקוז ל -4.5 גרם / ליטר) בצפיפות של 0.5-1 x 106 תאים / מ"ל בבקבוק תרבית תאים ודגור באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO₂.
   2. מעבירים את מדיית התרבית המכילה את תאי K562 לצינורות סטריליים של 50 מ"ל ומטילים את התאים בטמפרטורה של 300 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורה של 18-20 מעלות צלזיוס ביום הניסוי.
   3. שואפים את הסופרנטנט, מרחפים מחדש את התאים ב 5 מ"ל של PBS סטרילי, ומערבבים היטב בעדינות.
   4. גלול את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות. לשאוף את supernatant, להשהות מחדש את התאים PBS, ולהתאים את התאים K562 לריכוז של 0.5-1 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   5. הוסף 0.5 μL של צבע carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) ל- 1 מ"ל של תרחיף תאי K562 בצינור סטרילי של 15 מ"ל בריכוז סופי של 5 מיקרומטר. ערבבו בעדינות את המתלה על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות פי 3.
   6. השאירו את הצינור באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 10-15 דקות.
   7. הוסף 9 מ"ל של PBS לצינור וגלול את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות. דקנט את supernatant ולאחר מכן להשעות את גלולת התא ב 10 מ"ל של מדיה שלמה. מעבירים את תרחיף התא לבקבוק תרבית תאים ומניחים באינקובטור.
2. תאי OC-3
   1. תרבית תאי OC-3 במדיה שלמה (מדיום DMEM/F12 המכיל 10% FBS ואנטיביוטיקה 50 U/mL) בצפיפות של 0.5-1 x 10⁶ תאים בבקבוק תרבית תאים ב-37°C ו-5% CO₂.
   2. שאפו את אמצעי התרבית ושטפו את התאים עם PBS יום אחד לפני הניסוי.
   3. נתק את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת אנזים דיסוציאציה של תאים (טבלה של חומרים) ודגרה במשך 5 דקות ב 37 ° C.
   4. להשעות את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של PBS ולערבב היטב בעדינות. משחררים את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות ושאפו את supernatant. השהה מחדש את התאים ב- PBS והתאם את התאים לריכוז של 0.5-1 x 10⁶ תאים / מ"ל.
   5. הוסף 0.5 μL של צבע CFSE ל- 1 מ"ל של תרחיף תאי OC-3 בצינור סטרילי של 15 מ"ל בריכוז סופי של 5 מיקרומטר. ערבב בעדינות את המתלה על ידי פיטום למעלה ולמטה לפחות פי 3.
   6. השאירו את הצינור באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C ו-5%_CO2 למשך 10-15 דקות.
   7. הוסף 9 מ"ל של PBS לצינור וגלולה את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות. דקר את supernatant ולאחר מכן להשעות את גלולת התא עם מדיה שלמה. זרעו 5 x 10⁵ תאים / באר לתוך צלחת 6 באר ודגרו באינקובטור לח ב 37 ° C ו 5% CO₂ לילה.

7. בדיקה ציטוטוקסית

1. תרבות משותפת של תאי CIK ו-K562 (CIK-K562)
   1. ספור את תאי K562 משלב 6.1.7 ובדוק את כדאיות התא על-ידי בדיקת אי-הכללה של כחול טריפאן. הוסף 1 מ"ל של תאי K562 לכל באר בצלחת 6 בארות בצפיפות של 5 x 10⁵/mL.
   2. הוסף 1 מ"ל של תווך בסיסי עם או בלי תאי CIK משלב 3.4 לצלחת 6 באר משלב 7.1.1 כדלקמן: ובכן 1 = ריק, K562 תאים לבד (5 x 10⁵); באר 2 = תאי K562 מוכתמים ב- CFSE בלבד (5 x 10⁵); ובכן 3 = תאי CIK (E [אפקטור], 25 x 10⁵) + תאי K562 מוכתמים ב-CFSE (T [יעד], 5 x 10⁵); ובכן 4 = תאי CIK (E, 50 x 10⁵) + תאי K562 מוכתמים ב- CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. מערבבים את מתלי התאים על ידי פיטיפם בעדינות למעלה ולמטה לפחות פי 3. מניחים את הצלחת באינקובטור למשך 24 שעות.
2. קוהתרבות של תאי CIK ו-OC-3 (CIK-OC-3)
   1. הוסף 1 מ"ל של תווך בסיסי עם או בלי תאי CIK משלב 3.4 לצלחת 6 באר משלב 6.2.7 כדלקמן: ובכן 1 = ריק, תאי OC-3 לבד (5 x 105); ובכן 2 = תאי OC-3 מוכתמים CFSE לבד (5 x 10⁵); באר 3 = תאי CIK (E, 25 x 10⁵) + תאי OC-3 מוכתמים ב-CFSE (T, 5 x 10⁵); ובכן 4 = תאי CIK (E, 50 x 10⁵) + תאי OC-3 מוכתמים ב-CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. מערבבים את מתלי התאים על ידי פיטופם בעדינות למעלה ולמטה לפחות פי 3. מכניסים את הצלחת לאינקובטור למשך 24 שעות.
3. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) צביעת צבע
   1. קצור את תרחיף התאים CIK-K562 משלב 7.1.3 ישירות לתוך צינור סטרילי של 15 מ"ל.
   2. קצור הן את תאי התרחיף והן את תאי הדבק מקבוצות CIK-OC-3 משלב 7.2.2.
      1. מעבירים את תרחיף התא לצינור סטרילי בנפח 15 מ"ל. לשטוף את הבאר עם 1 מ"ל של PBS סטרילי, לאסוף את PBS, ולהוסיף את הצינור. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת אנזים דיסוציאציה של תאים, ודגר במשך 5 דקות ב 37 ° C.
      2. הוסף 1 מ"ל של התמיסה מאותו צינור לבאר המתאימה וערבב בעדינות את התאים על ידי pipeting אותם למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילית 1 מ"ל. לאסוף את כל התאים באותו צינור.
   3. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 10 דקות, שואפים את supernatant, ו resuspend את התאים ב 1 מ"ל של PBS סטרילי. משחררים את התאים ב 300 x גרם במשך 10 דקות, שואפים את supernatant, ו resuspend תאים ב 100 μL של PBS סטרילי.
   4. הוסף 5 μL של צבע 7-AAD (50 ng/μL מלאי) לתרחיף התא. מערבבים בעדינות את התאים על ידי פיפטם למעלה ולמטה לפחות 3x עם פיפטה סטרילית 1 מ"ל. יש לדגור במשך 10 דקות ולהשאיר בחושך לפני הניתוח.
4. בדיקת יכולת ציטוליטית
   1. ערבבו את מתלה התא משלב 7.3.4 וחזרו על שלבים 5.1 ו-5.2 פעם אחת.
   2. לחץ על הלחצן New Specimen כדי להוסיף דגימה וצינור לניסוי ולתת שמות לצינורות באופן הבא: תאי Tube 1, K562 (או OC-3) בלבד; צינור 2, תאי K562 (או OC-3) מוכתמים ב-CFSE בלבד; צינור 3, E:T = 5:1; צינור 4, E:T = 10:1.
   3. צרו מערכת פיזור עבור הבדיקה הציטוליטית (איור 2A).
      1. בחר Tube 1 ולחץ על Dot Plot כפתור ליצירת מגרש FSC-A/SSC-A. צייר שער מלבן מעל כל האירועים עם סף FSC-A >5 x 10⁴ כדי לא לכלול פסולת תאים.
      2. בחר בפרמטר SSC-A/CFSE עבור התוויית הנקודות החדשה. בחר את הפרמטר 7-AAD/CFSE עבור תרשים הנקודות החדש וצייר שער של ארבעה רבעים כדי להגדיר את ארבע תת-האוכלוסיות.
      3. לחץ על לחצן טען דוגמה כדי לנתח תחילה את דוגמת הבקרה הריקה.
      4. התאם את המתח של SSC-A ו- FSC-A. זהה את אוכלוסיית התאים המתים באמצעות הפרמטרים CFSE וערוץ 7-AAD. רשום את הנתונים מ- >20,000 תאי CFSE+ בכל דגימה.
   4. חזור על סעיף 7.4.6 לחקירת כל הדגימות.
   5. פתח את הקבצים המכילים את הערכים הסטטיסטיים של כל דגימה בודדת כדי לנתח את אוכלוסיות התאים שאינן בנות קיימא ולייצא את הנתונים לקבצי ניתוח.

תוצאות

איור 1: חלקם של תאי T CD3⁺CD56⁺ ממדגם PBMC מייצג. (A) לימפוציטים זוהו לפי גודל וגרעיניות ספציפיים. אוכלוסייה נבחרת של תא בודד לניתוח לפי ציטומטריית זרימה. (B) ניתוח סטטיסטי של יעילות הרחבת CIK משלושה תורמים בריאים בוצע באמצעות מבחן t (*, p < 0.01).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
7-אמינו אקטינומיצין D	ב.ד.	559925
עכבר APC נוגדן CD56 אנטי אנושי	ב.ד.	555518	B159
עכבר APC IgG1, κ בקרת איזוטיפ	ב.ד.	555751	MOPC-21
BD FACSCanto II ציטומטר זרימה	ב.ד.	338962		ס: R33896202856
Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסטר (CFSE)	ב.ד.	565082		שחזור של צבע CFSE (500 מ"ג) עם 90 מ"ל של DMSO
D-(+)-תמיסת גלוקוז	סיגמא	G8644		עבור תרבית תאים K562. הוסף 12.5 מ"ל ל 500 מ"ל של מדיום שלם
Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12	הייקלון	SH30023.02		מדיום בסיסי לתרבית תאים OC-3
סרום בקר עוברי	הייקלון	SH30084.03		עבור תרבית תאים K562 ו-OC-3. מדיום מלא מכיל 10% של FBS
פיקול-פאק פלוס	GE Healthcare מדעי החיים	71101700-EK		פתרון שיפוע צפיפות
עכבר FITC נוגדן CD3 אנטי אנושי	ב.ד.	555332	UCHT1
עכבר FITC IgG1, κ בקרת איזוטיפ	ב.ד.	555748	MOPC-21
אנושי אנטי CD3 mAb	TaKaRa	T210	OKT3	הוסף 2.5 מ"ל של מלאי (1 מ"ג / 1 מ"ל) ל 50 מ"ל של מדיום אינדוקציה. מלאי אחסון ב -80°C
פניצילין-סטרפטומיצין	גיבקו	15140122		הוסף 5 מ"ל מלאי (10,000 U/mL) ל- 500 מ"ל של מדיום שלם. מלאי אחסון ב-4°C.
פרולוקין	נוברטיס			הרכבה מחדש של אבקת פרולוקין (22x106 IU) עם 1.2 מ"ל של מים סטריליים ולהוסיף 2.7 מ"ל ל 50 מ"ל של מדיום אינדוקציה. מלאי אחסון ב -20°C
רקומביננטי אנושי אינטרפרון-גמא	CellGenix	1425-050		הרכבה מחדש של rh IFN-g (5x105 IU / 50 μg) עם 200 μL של מים סטריליים ולהוסיף 20 מ"ל ל 50 מ"ל של מדיום אינדוקציה. מלאי אחסון ב -20°C
רקומביננטי אנושי אינטרלוקין-1 אלפא	פפרוטק	200-01א		Reconstitution rh IL-1α (10 מיקרוגרם) עם 1 מ"ל מים סטריליים ולהוסיף 5 מ"ל עד 50 מ"ל של מדיום אינדוקציה. מלאי אחסון ב -20°C
RPMI1640 בינוני	גיבקו	11875-085		מדיום בסיסי לתרבית תאים K562. מלאי אחסון ב-4°C
סיגמא 3-18K צנטריפוגה	סיגמא	10295
טריפל אקספרס אנזים	גיבקו	12605028		אנזים דיסוציאציה של תאים; עבור deattachment של תאים דבקים. אחסון בטמפרטורת החדר
X-VIVO 15 בינוני	לונזה	04-418Q		מדיום בסיסי עבור תאי PBMC ו- CIK. אחסון ב-4°C