$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים משתתפים אנושיים בוצעו בהתאם להנחיות המוסדיות, הלאומיות והבינלאומיות לרווחת האדם ונבדקו על ידי מועצת הביקורת המוסדית המקומית.
1. הכנת ריאגנט
- הכן תמיסת מלאי של Culture Media לאיסוף רקמות שלמות: 1 ליטר של מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 110 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS), 11 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), ו-1.1 מ"ל של אינסולין מעוקר בפילטר (ריכוז סופי של 0.1%). אחסן תמיסת מלאי ב-4 מעלות צלזיוס.
- הכן מאגר כלאט #1: 30 מ"ל של מצע תרבית (כמתואר ב-1.1), 600 מיקרוליטר של 0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) (ריכוז סופי של 10 מ"מ), 300 מיקרוליטר של גנטמיצין (ריכוז סופי של 1%) ו-60 מיקרוליטר של אמפוטריצין B (ריכוז סופי של 0.2%). אחסן תמיסת מלאי ב-4 מעלות צלזיוס.
- הכן מאגר כלאט #2: 30 מ"ל של מצע תרבית (כמתואר ב-1.1), 300 מיקרוליטר של 0.5 מ"מ EDTA (ריכוז סופי של 5 מ"מ), 300 מיקרוליטר של גנטמיצין (ריכוז סופי של 1%) ו-60 מיקרוליטר של אמפוטריצין B (ריכוז סופי של 0.2%). אחסן תמיסת מלאי ב-4 מעלות צלזיוס.
- הכן אמצעי מעיים אנושיים: 41.4 מ"ל DMEM/F-12, 5 מ"ל FBS (10 סופיים%), 500 מיקרוליטר פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 1%), 500 מיקרוליטר L-גלוטמין (ריכוז סופי 1%), 500 מיקרוליטר גנטמיצין (ריכוז סופי 1%), 100 מיקרוליטר אמפוטריצין B (ריכוז סופי 0.2%), 500 מיקרוליטר של 1 M N-2-הידרוקסיאתילפיפרזין-N-2-אתאן חומצה סולפונית (HEPES) (ריכוז סופי 10 מ"מ), 500 מיקרוליטר של תוסף N-2 100x, ו-1 מ"ל של תוסף B-27 50x פחות ויטמין A לנפח כולל של 50 מ"ל. אחסן תמיסת מלאי ב-20 מעלות צלזיוס.
- הכנת מדיית מיני-מעיים אנושית מלאה: 10 מ"ל של מדיה מיני-מעיים אנושית (מוכנה ב-1.4), 10 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Wnt3a (ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל), 10 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל נוגין (ריכוז סופי 100 ננוגרם/מ"ל), 10 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל R-ספודין (ריכוז סופי 1 מיקרוגרם/מ"ל), 10 מיקרוליטר של 500 מיקרוגרם/מ"ל גורם גדילה אפידרמיס (EGF) (ריכוז סופי 50 ננוגרם/מ"ל), 10 מיקרוליטר של 1 מ"מ N-אצטילציסטאין (ריכוז סופי 1 מ"מ), 10 מיקרוליטר של 10 מ"מ Y-27632 (ריכוז סופי 10 מיקרומטר), 10 מיקרוליטר של 500 מיקרומטר A-83 (ריכוז סופי 500 ננומטר), 10 מיקרוליטר של 10 מ"מ SB202190 (ריכוז סופי 10 מיקרומטר), 100 מיקרוליטר של 1 M ניקוטינאמיד (ריכוז סופי 10 מ"מ) ו-1 מיקרוליטר של 100 מיקרומטר [leu] 15-גסטרין 1 (ריכוז סופי 10 ננומטר). נפח כולל 10 מ"ל. אחסן תמיסת מלאי ב-4 מעלות צלזיוס.
הערה: יש להשתמש בפתרונות תוך 48 שעות.
2. בידוד קריפטה וציפוי מרקמה שלמה
- בזמן האיסוף בסוויטה הניתוחית, הנח את דגימת רקמת המעי הדק האנושית בתמיסת מלח פוספט (DPBS) קרה של Dulbecco. שטפו את הדגימה ב-DPBS קר עד לנקות צואה ודם. אחסן דגימה ב-4 מעלות צלזיוס ב-RPMI 1640 בינוני עד שיהיה מוכן לבידוד קריפטה.
הערה: לא ניתן לאחסן טישו יותר מ-24 שעות.
- ודא שהדגימה נקייה מצואה ודם. בעזרת מספריים עדינים, הסר עודפי שומן או קליפסים/סיכות כירורגיות וכו'. שקלו את הדגימה.
הערה: כוון ליצירה בערך 0.75-2.5 גרם.
- חותכים את הדגימה לחתיכות של 0.5 ס"מ ומניחים ב-30 מ"ל של Chelating Buffer #1 (כפי שהוכן בשלב 1.2).
- יש לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- סנן רקמות דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר והשליך את הזרימה.
- הוסיפו את הטישו ל-30 מ"ל של Chelating Buffer #2 (כפי שהוכן בשלב 1.3).
- יש לנער במהירות נמוכה במשך 15 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- סנן רקמות דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר והשליך את הזרימה דרכה.
- הפשירו 500 מ"ל של מטריצת קרום המרתף על קרח לשימוש בשלב 2.8.
- הוסף רקמה ל-10 מ"ל DMEM קר בצינור חרוטי של 50 מ"ל ונער במרץ ביד במשך 10 שניות.
- סננו דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר ואספו זרימה דרכה (תווית #1). שמור את שפופרת #1 על קרח.
- הוסף רקמה לעוד 10 מ"ל של DMEM קר בצינור חרוטי נפרד של 50 מ"ל ונער במרץ ביד למשך 10 שניות.
- מסננים דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר ואוספים זרימה דרכה (תווית #2).
- חזור על הפעולה פעמיים נוספות עד שיש ארבעה צינורות חרוטיים עם זרימה דרכם (צינורות מסומנים #1-4).
- סינון תמיסת צינור #1 דרך מסננת תאים של 100 מיקרומטר והעברת זרימה לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל (תווית #1). חזור על הפעולה עבור #2-4.
- צנטריפוגה 15 מ"ל צינורות #1-4 ב-200 x g למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- במכסה המנוע הלמינארי, הסר את הסופרנטנט מהצינורות #1-4 והשליך. הימנעו מלשבש את ענן הרקמה שמעל הגלולה, גם אם זה אומר להשאיר קצת סופרנטנט מאחור.
- על ידי פיפטינג איטי, ערבבו יחד את הגלולה עם שאריות הסופרנטנט בצינורות #1-4.
- מעבירים את התערובת מצינורות #1-4 לצינור חרוטי אחד יחיד של 2 מ"ל.
- צנטריפוגה של הצינור החרוטי ב-200 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
- הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את הגלולה ב -500 מיקרוליטר של מטריצת קרום המרתף.
הערה: שמור את מטריצת קרום הבסיס על קרח כל הזמן ועבוד במהירות לשלבים הבאים. מוצר זה מתפלמר מהר מאוד בטמפרטורת החדר.
- החל 50 מיקרוליטר של מתלה מטריצת דגימה/קרום מרתף על מרכז באר בצלחת של 24 בארות. זה אמור להיראות בצורת כיפה.
הערה: שימוש בקצות פיפטה צוננים מסייע בהעברה חלקה יותר של המתלה, וממזער את הפילמור.
- חזור על הפעולה 9 פעמים כדי למלא 10 בארות בסך הכל.
- הנח את צלחת 24 הבארות בחממת 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור.
- הוסף 500 מיקרוליטר של Human Minigut Media Complete (כפי שהוכן בשלב 1.5) לכל באר. יש להחליף כל יומיים.
- אסוף אנטרואידים לאחר 5-10 ימים, כאשר מדמיינים ניצנים. ראה שלבים 4 ו-5 להוראות איסוף.
3. אינדוקציה של NEC ניסיוני
- הוסף 10 מיקרוליטר של 5 מ"ג/מ"ל של ליפופוליסכריד (LPS) ל-500 מיקרוליטר של חומר Minigut Human Minigut Complete (כפי שהוכן בשלב 1.5) בכל באר ביום 0. יש להחליף כל יומיים עד לאיסוף.