בדיקת הידבקות חוץ גופית לאיתור היצמדות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים

תקציר

Najmeh, S., et al. בידוד וטיפול במלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות אנושיות פשוטות (NETs). J. Vis. Exp. (2015)

בסרטון זה אנו מדגימים בדיקה המשתמשת במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לזהות הידבקות של תאים סרטניים למלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים (NET). בבארות הבדיקה ניכרת עלייה ניכרת במספר התאים הסרטניים המסומנים באופן פלואורסצנטי הנצמדים ל-NETs, בעוד שבבארות שטופלו ב-DNase נרשמה היצמדות מופחתת של תאים סרטניים ל-NETs.

פרוטוקול

1. בדיקת הדבקה סטטית של תאי סרטן NET-Cancer

1. הוסף 100 μl של מלאי נטו שהושג בעבר לכל באר בלוח תחתון שטוח 96 בארות ולאפשר לצפות בארות O/N ב 4 ° C בחושך.
2. בין 12 ל-20 שעות מאוחר יותר, ודאו היווצרות של שכבה אחידה של רשתות נטולות תאים בתחתית הבארות מתחת למיקרוסקופ (איור 1). בשלב זה, שאפו בעדינות את כל החומר שאינו נדבק אל מחוץ לבארות, והקפידו לא לשבש את שכבת הרשת בתחתית.
3. הוסף 100 μl של 1% תמיסת חסימת אלבומין בסרום בקר (BSA) לכל באר והשאר למשך שעה אחת ב- RT.
4. נתק תאי סרטן A549 מבקבוק T-75 באמצעות 2 מ"ל של תמיסת טריפסין 0.25%. לאחר הניתוק, יש להוסיף 10 מ"ל של חומרי הדפסה A549 לתאי טריפסינציה ולצנטריפוגה בטמפרטורה של 450 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. השליכו תאי סופרנאטנט והשהיה מחדש במדיה כדי לקבל ריכוז של 2 x10⁴ תאים סרטניים לכל 100 μl media.
   הערה: תאי A549 גודלו בנפרד. בקצרה, תאים גודלו בתרבית ונשמרו במדיה DMEM F12 המכילה 10% FBS ו-1% פניצילין סטרפטומיצין ומודגרת ב-37°C 5% CO₂. ברגע שהגיעו למפגש תאים של 70-80%, הם נותקו באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA והושעו מחדש באותה מדיה שתוארה לעיל.
5. לצבוע תאים סרטניים באמצעות CFSE על ידי הוספת 1 μl של CFSE לכל מ"ל של מדיה ולהשאיר אותו להכתים ב RT במשך 10 דקות. לאחר הצביעה, צנטריפוגה למטה ב 450 x גרם ב 4 ° C במשך 5 דקות ולאחר מכן להשליך supernatant ו resuspend תאים בנפח הראשוני של מדיה כדי לקבל ריכוז של 2 x10⁴ תאים סרטניים לכל 100 μl מדיה.
6. לאחר שעה של חסימת NETs, שאפו בעדינות את התמיסה החוסמת והוסיפו 2x10⁴ תאים סרטניים במדיה, שהם שווי ערך ל -100 μl, לכל באר מעל השכבה החד-שכבתית נטו ואפשרו לה להיצמד במשך 90 דקות ב 37 °C 5% CO₂. שאפו בעדינות את התאים והוסיפו 100 μl של PBS לכל באר כדי לשטוף תאים שאינם דבקים.
7. בחלק מהבארות, יש להוסיף 1000U של DNAse I לכל באר למשך 10 דקות לפני הכביסה כדי לפרק רשתות. זה ישמש שליטה שלילית. בבארות אחרות, הוסף 100 μl של מים סטריליים לכל באר למשך 10 דקות, אשר ישמשו כבקרת הרכב (VC).
   הערה: 3 עותקים משוכפלים לכל תנאי מבוצעים בדרך כלל כדי להגדיל את הדגימה.
8. לשאוף ולהשליך את כל הפתרונות בבארות ולהשאיר רק NETs ותאים סרטניים דבקים בתחתית. הוסף 100 μl של תמיסת פורמלדהיד 4% לכל באר כדי לקבע תאים סרטניים דבקים ל- NETS וקרא את הבדיקה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 1). תכננו ונתחו את התוצאות (איור 2).

תוצאות

איור 1. מונולייר נטו. תמונות במיקרוסקופ אור של בארות הלוחות בנות 96 הקידוחים המצופים ב-NETs מראות (A) שכבה אחידה של NETs לאורך כל הבאר, בניגוד ל-(B) ציפוי לקוי של הבאר בשכבה קטועה של NETs. פסי קנה מידה מייצגים 40 מיקרומטר.

איור...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פוספט חוצץ מלוחים (PBS) של Dulbecco, מעובד, ללא סידן כלורי ומגנזיום כלורי	וויסנט	311-425-CL
RPMI-1640 בינוני עם L-גלוטמין	וויסנט	350-000-CL	תמיסת 3% RPMI מיוצרת על ידי תוספת RPMI עם סרום בקר עוברי 3%
BD Pharm Lyse חיץ Lysing	BD Biosciences	555899
DNAse1	רוש	11284932001
F12 DMEM	וויסנט	319-075-CL
סרום בקר עוברי (FBS)	וויסנט	080-150
פניצילין/סטרפטומיצין	גיבקו	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% טריפסין-EDTA	גיבקו	25200-056