צביעת תאי חיידקים והכנה למחקרים אימונולוגיים

תקציר

מקור: Yang, J. et al., זיהוי אוטומטי, בתפוקה גבוהה של דבקות חיידקים בתאים מארחים.J. Vis. Exp. (2021)

סרטון זה מדגים צביעה והכנה של תאי חיידקים למחקרים אימונולוגיים באמצעות צבע פלואורסצנטי אדום. החיידקים המוכתמים מדוללים ומרחפים מחדש במדיום גדילה כדי להשיג את ריכוז החיידקים הרצוי לזיהום תאי המאכסן, המייצג את ריבוי הזיהום.

פרוטוקול

1. גידול חיידקים והכתמה

1. בצע את כל עבודות החיידקים בארון בטיחות ביולוגית, מעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2.
2. חסן את כל תרביות החיידקים, כולל Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis וכו ', ממלאי גליצרול קפוא וגדל אותם בציר סויה טריפטי (TSB, 3 מ"ל) באינקובטור רועד ב 37 ° C במשך הלילה נשמר ב 250 סל"ד.
3. למחרת, השתמש בדילול של 1:100 של תרבית הלילה כדי לחסן תת-תרבות ולגדל אותם ב- TSB (1 מ"ל) במשך 3 שעות לשלב המעריכי, מדוד את הצפיפות האופטית, OD ב- 600 ננומטר (OD₆₀₀) כדי לאשר. ודא כי OD₆₀₀ הוא בטווח של 0.4-0.6.
4. לפני ביצוע בדיקת היצמדות חיידקים-מארחים, יש לדלל את הצלחות הסדרתיות של תרחיף חיידקי על צלחות TSB-agar, לדגור עליהן למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C ולאחר מכן להקים את יחידות יצירת מושבת החיידקים, CFUs ממספר המושבות. עבור P. aeruginosa, OD₆₀₀ של 1.0 מתאים ל 2 x 10⁸ תאי חיידקים קיימא / מ"ל, ועבור L. monocytogenes, OD₆₀₀ של 1.0 מתאים 9 x 10⁸ תאים חיידקיים קיימא / מ"ל.
5. קצרו את תרביות החיידקים בשלב מעריכי על ידי צנטריפוגה במהירות של 13,000 x גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT), ולאחר מכן שטפו אותן פעם אחת באמצעות מלח חוצץ פוספט 1x (PBS 1 מ"ל). להשהות מחדש את כדורי החיידקים ב 1 מ"ל של 1x PBS ולקבוע את הריכוזים על ידי מדידת OD₆₀₀ של תרחיפים חיידקיים. לדוגמה, P. aeruginosa עם OD₆₀₀ של 0.5 מייצג ריכוז של 1 x 10⁸ תאי חיידקים/מ"ל.
6. הכתימו את המתלה החיידקי באמצעות צבע פלואורסצנטי ירוק או אדום ב-RT למשך 30 דקות עם סיבוב עדין בחושך. לשם כך, הוסף 2 μL של צבע מכתים מרוכז פי 500 לתוך 1 מ"ל של תרחיף חיידקי כדי לדלל את הצבע פי 1. כדי לשטוף את הצבע המכתים, צנטריפוגו את החיידקים המוכתמים ב 13,000 x גרם למשך 2 דקות והשהו מחדש את הגלולה ב 1 מ"ל של 1x PBS שלוש פעמים.
   הערה: אם נעשה שימוש בחיידקים פלואורסצנטיים (חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP-), חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP-), mCherry וכו', דלג על שלב צביעת חיידקים זה. P. aeruginosa המתויג GFP ומונוציטוגנים L. monocytogenes בצבע פלואורסצנטי אדום שימשו בפרוטוקול זה.
7. אספו את תאי החיידקים המוכתמים או את החיידקים המתויגים ב-GFP באמצעות צנטריפוגה במהירות של 13,000 x גרם למשך 2 דקות. השהה מחדש בתווך F-12K טרי (1 מ"ל) ומדוד את OD₆₀₀ של כל תרבית. לאחר מכן לדלל את התרביות לריכוזים הרצויים בהתבסס על ריבוי הזיהום (MOI) וריכוז התאים המארחים. הנפח הסופי המשמש בניסוי זה הוא 500 μL.
   הערה: לדוגמה, אם ריכוז התא המארח שנספר באמצעות צביעת Trypan Blue הוא 1 x 10⁵ תאים/מ"ל, הריכוז הרצוי של תאי חיידקים ב-MOI של 100 יהיה 1 x 10⁷ תאים/מ"ל. ריכוז P. aeruginosa ב 0.5 OD₆₀₀ הוא 1 x 10⁸/mL. כדי להשיג את הריכוז הרצוי, לדלל את תרבית P. aeruginosa פי 10, ולהוסיף 50 μL של תרבית מרחפת ל 450 μL של מדיום F-12K טרי.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10x PBS	VWR	45001-130
BactoView אדום חי	ביוטיום	40101	חיידקים עוקצים צבע
צנטריפוגה	אפנדורף	5810R
אי קולי			מלאי מעבדה
F-12k בינוני	ATCC	302004	מדיום תרבית תאים A549
סרום בקר עוברי	קורנינג	35-016-CV
ל. מונוציטוגנים			אוספי NIST
OD600 DiluPhotometer	אימפלן
פ. ארוגינוסה			מלאי מעבדה של ד"ר לורי בורוז
P. aeruginosa ΔpilA			מלאי מעבדה של ד"ר לורי בורוז
ס. agalactiae			אוספי NIST
ס. אוראוס	ביי	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	ביי	NR-48164
ס. רובידאה			אוספי NIST
מרק סויה טיפוסי	תאי גידול	MBPE-4040