הערכה של זרחן חלבוני תוך-תאי המושרה על ידי ציטוקינים סטרומה באמצעות ציטומטריה של זרימת זרחן

תקציר

מקור: Coats, J. S., et al. ביטוי של ציטוקין אקסוגני ב Xenografts נגזר המטופל באמצעות הזרקה עם ציטוקינים מומר קו תאי סטרומה. J. Vis. Exp. (123) (2017).

סרטון זה מדגים את ההערכה של זרחן תוך-תאי המושרה על ידי ציטוקינים סטרומה של חלבונים בתאי לוקמיה. חלבונים זרחניים תוך-תאיים אלה מכומתים באמצעות טכניקת הציטומטריה של זרימת זרחן.

פרוטוקול

1. בדיקות ציטומטריה של זרימת פוספו להערכת פעילות הציטוקין המיוצר על ידי סטרומה

הערה: הערך את הסופרנאטנט מהסטרומה המהונדסת לפני הניסוי הראשון כדי לאמת את הפעילות הביולוגית הרלוונטית של הציטוקין שנוצר על ידי סטרומה עבור הניסוי הבודד. לאחר אימות הסטרומה המהונדסת, אין צורך בבדיקות נוספות אלא אם כן הוכנסו סטרומה שיוצרו עם וקטור חדש.

1. רכוש קווי תאי לוקמיה MUTZ5 ו/או MHH-CALL4 (TSLP reponsive), ציטוקין אנושי רקומביננטי ונוגדנים שאושרו לשימוש בבדיקות ציטומטריה של זרימת פוספו כדי לזהות מטרות זרחן מתאימות במורד הזרם.
2. הפשרה קוצרת סופרנאטנט מבקרה וסטרומה המבטאת ציטוקינים.
3. לוחית את שורות תאי הלוקמיה בתווך R20 (ראה טבלת חומרים) בריכוז של 0.2 x 10⁶ תאים לבאר בצלחת תרבית רקמה של 96 בארות. צלחת 3 בארות לכל תנאי כדי לאפשר בדיקות משולשות. לדגור במשך 2 שעות ב 37 ° C. זמן זה מאפשר אובדן של כל זרחן שהתרחש בתנאי תרבית קודמים.
   הערה: 12 בארות לכל קו תא מספקות בדיקות משולשות עבור כל תנאי ניסוי המוצג בשלב 1.4.
4. לאחר 2 שעות בתרבית, להעביר את התאים מכל באר להפריד צינורות 4 מ"ל צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ב 4 ° C. דקנט את supernatant.
   1. להשהות מחדש את התאים ב-200 μL עבור כל אחד מתנאי הניסוי הבאים (לבצע בדיקות בטריפליקט): 1) אמצעי בקרה שליליים בלבד, 2) אמצעי בקרה חיוביים עם ציטוקין רקומביננטי בריכוז(ים) רוויים (TSLP ב-15 ננוגרם/מ"ל וכו'), 3) בקרת סטרומה-סופרנאטנט מסטרומה בקרה, ו-4) ציטוקין-סטרומה-סופרנאטנט מסטרומה מייצרת ציטוקינים.
5. לדגור על התאים למשך הזמן שצוין על ידי בדיקת פוספו מסחרית ספציפית (למשל 30 דקות עבור phospho-STAT5 ב- MUTZ5 או MHH-CALL4 בתגובה ל- TSLP).
6. צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C ו decant supernatant.
7. בצע צביעת ציטומטריה של זרימת זרחן בהתאם לפרוטוקול היצרן ואסוף נתוני ציטומטריית זרימה.
8. ניתוח נתוני ציטומטריית זרימה.
   1. שער על תאים שלמים בהתבסס על פיזור אור קדימה (FSC, מציין גודל תא) וצד (SSC, מציין גרעיניות התא).
   2. קבע את העוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI) של התאים השלמים בכל דגימה. השווה את ממוצע ה- MFI המתקבל מהערכים המשולשים של סופרנאטנט תאי סטרומה לזה של בקרות מדיה חיוביות ושליליות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
10 מ"ל פיפטות סרולוגיות	בז	357551
15 מ"ל צינורות חרוטי פוליפרופילן	פישר	05-539-12
50 מ"ל צינורות חרוטי פוליפרופילן	בז	352098
1 מ"ל פיפטה טיפים	פישר	2707509
200 μL פיפטה טיפים	דנוויל סיינטיפיק	P3020-CPS
10 μL קצוות פיפטה	דנוויל סיינטיפיק	P-1096-CP
"R20" תרבית תאים בינוני, % מהנפח הכולל (עושה 195 מ"ל)			מתכון מעבדה
סל"ד, 76.84% (150 מ"ל)	מדיהטק	10-040-CV
FBS, 20.49% (40 מ"ל)	מדיהטק	35-011-CV
2mM L-גלוטמין, 1.02% (2 מ"ל)	מדיהטק	35-011-CV
1 מ"מ פירובט, 1.02% (2 מ"ל
פניצילין-סטרפטומיצין, 0.51% (1 מ"ל	מדיהטק	30-002-CL
2-מרקפטואתנול, 0.10% (0.1 מטר), 0.10% (200 מיקרוליטר)	מגה	190242
מוצרים ביולוגיים
"CALL-4" MHH-CALL-4 קו תאים, לוקמיה מבשרת תאי B אנושיים	DSMZ	ACC 337
קו תאי MUTZ-5, לוקמיה מבשרת של תאי B אנושיים	DSMZ	ACC 490
חלבון TSLP אנושי רקומביננטי	מערכות מו"פ	1398-TS-010
נוגדנים ציטומריים לזרימה (שיבוט)*
נגד עכבר CD45 FITC (30F11)	Miltenyi ביוטק	130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (שם חלופי הוא IL-7Rα)	Miltenyi ביוטק	130-098-094
נגמ"ש CD34 (8G12)	BD Biosciences	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBioscience	25-0459
"FVD" צבע כדאיות לתיקון eFluor 780	eBioscience	65-0865
Ig κ שרשרת אור FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ שרשרת אור FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	ביולג'נד	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Biosciences	551079
pSTAT5 PE, עכבר נגד STAT5 (pY694)	BD PhosphoFlow	612567
חומרים וציוד אחרים
תוכנה לניתוח ציטומטריית זרימה FlowJo	FlowJo, LLC	גרסה 10
*כל הנוגדנים הם אנטי-אנושיים אלא אם צוין אחרת.

)