$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת רקמות לקיבוע ושיבוץ פרפין
הערה: ביופסיות נלקחו מנשים בהסכמה שעברו ציסטוסקופיה עם אלקטרו-פולגורציה של טריגוניטיס לניהול מתקדם של דלקות חוזרות בדרכי השתן (rUTI). rUTI מוגדר כ-3 זיהומים בדרכי השתן ב-12 חודשים. איסוף הביופסיה בוצע בחדר הניתוח בזמן שהמטופל היה תחת הרדמה לאחר קבלת הסכמת המטופל מדעת. כל הדגימות קודדו והוסרו מהזיהוי לפני הניסוי.
- יש לקבל ביופסיה של קרה (~1 מ"מ3) מהטריגון של שלפוחית השתן עם מלקחיים אורולוגיים באמצעות ציסטוסקופ גמיש ולהכניס מיד לקריביאל סטרילי של 2 מ"ל המכיל 1.5 מ"ל של 4% v/v paraformaldehyde (PFA) המוכן במי מלח סטריליים חוצצים פוספט (PBS).
הערה: ניתן להכין מראש 4% PFA ב-1x PBS ולאחסן בטמפרטורה של -20°C עד לצורך.
- תקן ביופסיה במשך 6 שעות בטמפרטורת החדר או במשך 16-24 שעות ב 4 ° C.
הערה: יש לחשב את משך הקיבוע על בסיס גודל דגימת הרקמה ולהימנע מקיבוע יתר. לא מומלץ להשתמש בגלוטראלדהיד כחומר קיבוע מכיוון שהוא מציג אוטופלואורסצנטיות.
- במכסה מנוע מעוקר או בארון בטיחות ביולוגית, הסר את הקיבוע על ידי צנרת והחלף אותו ב- 1.5 מ"ל של מלח סטרילי 1x חוצץ פוספט (PBS). שמור את הדגימות על 4 ° C במשך הלילה או מיד לבצע עיבוד רקמות והטבעה פרפין.
- השתמש במיקרוטום מעוקר כדי לחתוך גושי רקמה בעובי 5 מיקרומטר ולהדביק חלקי רקמת פרפין לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית טעון. לפחות שתי שקופיות לכל ביופסיה יידרשו עבור פרוטוקול 16S RNA ריבוזומלי (16S rRNA) פלואורסצנטיות באתרו (FISH) פרוטוקול.
הערה: רקמת הביופסיה צריכה להיות מסודרת בחתך רוחבי ביחס למישור החיתוך על מנת להבטיח הדמיה של שכבות השתן בכל המקטעים. כמו כן יש לציין כי עובי החתך צריך להיות מותאם לזיהוי קהילת חיידקים. חלקים דקים יותר או דגימה של מקטעים סדרתיים מרובים עשויים להידרש במקרה של זיהומים שבהם חיידקים שוכני רקמות הם נדירים ביותר (למשל, <חיידק אחד תושב רקמה לכל 1,000 תאי יונקים).
2. הכלאה פלואורסצנטית באתרו עם בדיקות rRNA אוניברסליות 16S
הערה: נדרשות שתי שקופיות לכל ביופסיה. יש צורך בשקופית אחת עבור הגשושית rRNA האוניברסלית 16S ובשקופית אחת עבור גשושית בקרה עם רצף מקושקש. זה חשוב להבחנה בין האות האמיתי לבין אות הרקע במהלך מיקרוסקופיה מכיוון שאפיתל שלפוחית השתן הוא פלואורסצנטי אוטומטי במספר ערוצים. בנוסף לבדיקה המקושקשת, חסימה עם 0.1% סודן שחור B לפני ההרכבה עשויה להפחית את האוטופלואורסצנטיות ברקע הטבועה ברקמה.
- הכנת ריאגנטים ומכסה אדים
- נקו מכסה אדים ריק (או ארון בטיחות ביולוגי מותאם כראוי) עם 70% אתנול.
- הכינו את חיץ ההכלאה המורכב מנתרן כלורי 0.9 מ"מ (NaCl), 20 מ"מ טריס (הידרוקסימתיל) אמינומתאן-הידרוכלוריד (Tris-HCl, pH 7.2), 0.1% נתרן דודציל סולפט (SDS) ב-10 מ"ל מים סטריליים מסוננים.
הערה: ניתן להכין מים מסוננים סטריליים על ידי העברת מים מזוקקים אוטוקלאביים דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. ניתן לאחסן את מאגר ההכלאה בטמפרטורת החדר, אך ה-SDS עשוי לזרז מהפתרון. אם יש שקע SDS, יש לחמם את התמיסה באמבט מים בטמפרטורה של 50°C לפני השימוש.
- הכינו לפחות 100 מ"ל כל אחד של 95% ו-90% אתנול במים סטריליים מסוננים בבקבוקים שטופים ואוטומטיים.
- יש להמיס בדיקות ליופיליות בעלות תווית פלואורסצנטית ב-10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ובמאגר 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (TE) המוכן במים נטולי נוקלאז מעוקרים במסנן לריכוז סופי של 100 μM. הכן דילול של 1 מיקרומטר במאגר TE לשימוש בפרוטוקול זה. אחסנו הן מלאי מרוכז של 100 מיקרומטר והן מלאי של 1 מיקרומטר בטמפרטורה של -20°C המוגנים מפני אור.
הערה: אין להמיס בדיקות עם תווית פלואורסצנטית במים. חציצה נדרשת כדי למנוע הידרוליזה של קשר אסטר N-hydroxysuccinimide (NHS) המצמיד את הפלואורופור לבדיקת הנוקלאוטידים.
- נקו חמש צנצנות קופלין עם 70% אתנול (EtOH), הניחו לייבוש, סמנו כך: xylenes I, xylenes II, 95% EtOH, 90% EtOH, מים מזוקקים פעמיים (ddH2O), ומלאו ב-100 מ"ל של התמיסה המתאימה. זה יעזור למנוע בלבול בשלבים מאוחרים יותר.
- רקמות de-paraffinization ו rehydration
- במכסה המנוע, הניחו שתי מגלשות בכל ביופסיה במדף שקופיות אנכי.
- הניחו מתלה שקופיות אנכי בצנצנת קסילנים I Coplin (המכילה 100 מ"ל קסילנים) למשך 10 דקות.
- הסר את מתלה השקופיות מ- xylenes I וכתם את התחתית על מגבת נייר כדי להסיר עודפי xylenes. מכניסים לצנצנת קופלין II למשך 10 דקות< בר/>
הערה: לעולם אל תעבוד עם קסילנים מחוץ למכסה אדים מאושר.
- התייבשו חלקי רקמות שעברו דה-פרפין בשטיפות אתנול עוקבות (95% ו-90%) למשך 10 דקות כל אחת בצנצנות Coplin המסומנות בהתאמה.
הערה: בשלב זה, חממו את מאגר ההכלאה ל-50-56 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הסר את מתלה השקופיות משטיפת אתנול 90%, כתם את התחתית על מגבות נייר כדי להסיר אתנול עודף, והכנס לצנצנת ddH2O Coplin המכילה 100 מ"ל של ddH2O מעוקר מסנן למשך 10 דקות.
- בזמן ההמתנה לשטיפת ddH2O, דללו את הגשושיות ל-10 ננומטר במאגר הכלאה כדי ליצור את תמיסת הצביעה. הכינו 150 מיקרוליטר של תמיסת צביעה בכל שקופית.
הערה: הגן על תמיסת הצביעה מפני אור על ידי עטיפת הצינורות ברדיד אלומיניום ואחסונם במגירה. בעת עבודה עם גשושיות עם תווית ניאון על הספסל, שקול לכבות אורות עיליים כאשר הדבר אפשרי. אין לעשות שימוש חוזר בבדיקות המדוללות במאגר ההכלאה.
- הכלאה וצביעת נגד
- הכינו תא לחות לכל בדיקה על ידי הנחת קימניגונים ספוגים, מקומטים ומים סטריליים במאגר של קופסת קצה P1000. הניחו את מחסנית מחזיק החוד למעלה - כאן השקופיות יושבות.
הערה: חשוב להשתמש בתא לחות כדי למנוע מקטעי הביופסיה להתייבש במהלך ההכלאה. יש לציין כי תאי אדים זמינים מסחרית נועדו לשמור על אווירה יציבה ולחה. עם זאת, הטכניקה המפורטת כאן שולטת מספיק בלחות בעלות נמוכה משמעותית.
- הסר את המגלשות ממדף השקופיות והנח אותן על מגבת נייר טרייה (בצד הטישו כלפי מעלה). השתמשו במגבון Kimwipe כדי לייבש את המגלשה. יש להקפיד לטפוח בעדינות רק ליד (לא על) קטע הביופסיה כדי לנדף מים. בעזרת עט הידרופובי, ציירו גבול סביב קטע הביופסיה והניחו את רקמת ההחלקה כלפי מעלה בתא הלחות.
הערה: יש לעבוד במהירות כדי שהרקמות לא יתייבשו לפני ההכלאה.
- מניחים את תא הלחות לתוך אינקובטור להגדיר 50 מעלות צלזיוס. פיפטה 50-150 μL של תמיסת הצביעה ישירות על גבי הרקמה, כך המלבן שנוצר על ידי הגבול הידרופובי סביב הרקמה מלא. היזהר לא להוסיף יותר מדי פתרון כדי להציף את הגבול הידרופובי. סגור את הקופסה בעדינות.
- לדגור לילה (~ 16 שעות) ב 50 ° C בחושך. אם לאינקובטור יש חלון, כסו אותו ברדיד אלומיניום כדי ליצור סביבה חשוכה.
הערה: נדרשת טמפרטורת הכלאה מתחת לטמפרטורת ההתכה של הגשושית FISH לקבלת אות אמין. 50 °C היא הטמפרטורה האופטימלית עבור בדיקת rRNA אוניברסלית 16S, אך ייתכן שלא תהיה אופטימלית עבור בדיקות אחרות.
- למחרת בבוקר, הכינו לפחות 500 מ"ל של חיץ Wash המורכב מ-0.9 M נתרן כלורי (NaCl), ו-20 mM Tris-HCl (pH 7.2) ב-ddH2O ובצעו חיטוי-סינון לבקבוק סטרילי עם מסנן ואקום עליון. חם ל 50-56 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- הסר את המגלשות מתאי הלחות ופתל בזהירות כל פתרון הכלאה שנותר עם Kimwipe. הניחו את השקופיות במדף צביעה אנכי.
- הכניסו את מתלה הכתמים לצנצנת קופלין אטומה המכילה 100 מ"ל של חיץ כביסה שחומם מראש למשך 10 דקות. אם צנצנות קופלין אינן אטומות (למשל, זכוכית), הניחו אותן בחושך במהלך שלבי הדגירה – אולי מתחת לקופסה או במגירה.
- חזרו על שלב השטיפה פעמיים עם חיץ כביסה טרי בצנצנות קופלין חדשות.
- במהלך שלבי השטיפה, הכינו את הכתם הנגדי על ידי דילול תמיסת מלאי של 100 מיקרוגרם/מ"ל של Hoechst 33342 ביחס 1:1,000 במאגר הכביסה. לאותה צינור, הוסף את Alexa-555 wheat germ agglutinin (WGA) לריכוז סופי של 5μg/mL ואת Alexa-555 Phalloidin לריכוז סופי של 33 ננומטר. יש לאחסן בחושך עד שיהיה מוכן לשימוש.
הערה: Hoechst, Alexa-555 WGA ו-Alexa-555 Phalloidin מגדירים חומצה דאוקסיריבונוקלאית (DNA), מוצין/אורופלאקינס ואקטין בהתאמה, וניתן לאחסן אותם לטווח ארוך בחושך בהתאם להוראות היצרן. תוויות פלואורסצנטיות המשמשות לגשושיות וכתמי נגד ניתנות להתאמה אישית עבור ערכות המסננים הזמינים לשימוש במיקרוסקופ.
- הסירו את המגלשות מהשטיפה האחרונה ופתילו בעדינות את עודפי חיץ הכביסה בעזרת מגבון Kimwipe. הניחו את המגלשות בצד הרקמה על מגבת נייר והוסיפו 50-150 מיקרוליטר של כתם נגדי ישירות על גבי הרקמה, כך שהגבול ההידרופובי יתמלא, אך לא יעלה על גדותיו. מכסים עד ארבע שקופיות עם קופסת קריו, ודגרים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- החזירו את הדפנות למתלה הצביעה ושטפו פעמיים נוספות בצנצנות קופלין עם חיץ כביסה טרי, למשך 10 דקות כל אחת.
- יבשו היטב את המגלשות לאחר הכביסה האחרונה והניחו את צד הטישו על מגבת נייר מתחת לקופסת קריו. יש לסחוט טיפה אחת של אמצעי הרכבה ישירות על גבי הרקמה. מניחים בעדינות מכסה בגודל מתאים (תלוי בגודל הביופסיה) על גבי. לחץ בעדינות על כל הבועות מכיוון שהן יפריעו להדמיה ויאפשרו לשקופיות הכיסוי להירפא בן לילה בחושך.
- למחרת, אטמו את שולי הכיסוי למגלשה עם שכבה קלה של לק שקוף. אפשר להתייבש במשך 10 דקות בחושך ולאחר מכן לאחסן בחושך ב 4 ° C עבור מיקרוסקופ קונפוקלי.
3. הדמיה של דגי rRNA 16S במיקרוסקופ קונפוקלי
הערה: עבור פרוטוקול זה, התוצאות הטובות ביותר מושגות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם מטרות 63x ו- 100x. נדרשות ערכות סינון מתאימות להדמיה של פלואורסצנטיות Hoechst, Alexa-488 ו- Alexa-555. עם זאת, ניתן להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי אם מיקרוסקופ קונפוקלי אינו זמין. פרוטוקול זה מיועד למיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר.
- הפעל את המיקרוסקופ הקונפוקלי ואת תוכנת המחשב המשויכת למיקרוסקופ בהתאם להוראות היצרן.
- טען את השקופית והצג אותה באופן חזותי עם המטרה 10x בערוץ הכחול (Hoechst). התמקדו בזהירות עד שהגרעינים גלויים.
- לאחר התמקדות, שנה את המטרה להגדלה גבוהה (63x או 100x). מוסיפים שמן על גבי הכיסוי. התמקד מחדש במטרה החדשה, וודא שעדשת האובייקט באה במגע עם שמן בזמן המיקוד.
הערה: השתמש רק במיקוד עדין בהגדלה גבוהה (63x או 100x). יש להשתמש בנפט רק למטרה של נפט.
- הערך במהירות כל שקופית דרך פיסת העין בערוץ הירוק (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר, eGFP/Alexa-488) כדי לקבוע אילו שקופיות חיוביות ל- FISH ואילו שליליות ל- FISH.
הערה: עדיף שההערכה/הניקוד הראשוני הזה ייעשה מסונוור על ידי אדם נפרד כדי להפחית את הטיית הניסוי.
- כדי לצלם את הביופסיות המוכתמות, התחל עם שקופית חיובית של FISH ועבור למצב הדמיה ממוחשבת. בחר את הערוצים 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) ו- 555 (Alexa-555). הגדר את חור הסיכה באמצעות ערוץ אורך הגל הארוך ביותר, במקרה זה 555. מצא את מישור המוקד הנכון להדמיה של חיידקים מסומנים בערוץ 488. מבלי לשנות את מישור המוקד, הגדר את הרווח, עוצמת הלייזר וההיסט עבור כל ערוץ כך שהאות לא יהיה רווי והרקע לא יתוקן יתר על המידה. רכוש את התמונה בכל שלושת הערוצים.
הערה: השתמש באותן הגדרות עבור ערוץ 488 כדי לצלם כל שקופית בניסוי. עוצמת הלייזר עשויה לדרוש התאמה בערוצים 405 ו- 555 אם מישור המוקד האופטימלי להדמיה חיידקית משתנה בין השדות.