טכניקת In Vitro ליצירת תאי T אפופטוטיים בתיווך הקרנת UV

תקציר

מקור: Hodge, M. X., et al. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage efferocytosis בעקבות חשיפה לאוזון. J. Vis. Exp. (2019).

סרטון זה מדגים שיטה לגרימת אפופטוזיס בתאי Jurkat – קו תאי לוקמיה של לימפוציטים מסוג T אנושי. התאים חשופים לקרינת UVC (Ultraviolet C), הגורמת לנזק נרחב לדנ"א ומובילה למוות תאי אפופטוטי.

פרוטוקול

1. הכנת קו תאי Jurkat T (יום 2)

הערה: כל ההליכים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי סוג II.

1. תרבית תאי Jurkat T ב 24 מ"ל של תרבית תאי בסיס בינוני + 10% FBS + 5% פניצילין/סטרפטומיצין ב 37 ° C + 5% CO₂ (טבלה של חומר). תאי Jurkat T הם קו תאי תרחיף שניתן לשמור עליו באמצעות העברת 1:6-1:8 למצע תרבית שחומם מראש כל 3 ימים. אין לרעוד.
2. כדי להכין תאים אפופטוטיים, לגדל אותם ל 90% מפגש בכל בקבוק (אשר לוקח 3-4 ימים כדי להשיג לאחר עובר). במחקר זה, השתמש בתאים מחמש צלוחיות T75 כדי להשיג מספר מספיק של תאים המשמשים בפרוטוקול זה.
   הערה: בקבוק שוטף מכיל כ 20-24 מיליון תאים.
3. פיפטה למעלה תאים (שהיא כל הצלוחית) מכל בקבוק (כ 24 מ"ל) ולהעביר תאים לצינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית. השתמש בצינורות חרוטיים מרובים עבור צלוחיות מרובות.
4. ספירת תאים על ידי הסרת אליציטוט של 11 μL של תאים מצינור חרוטי 50 מ"ל וערבוב עם 11 μL של כתם כחול טריפאן פיפטה 11 μL על שקופיות המוציטומטר.
5. הכנס את השקופית למונה תאים אוטומטי ורשום את מספר התאים החיים כדי לחשב את ספירת התאים הכוללת בכל בקבוק על-ידי הכפלת מספר התאים החיים ב- 24, מכיוון שכל בקבוק מכיל 24 מ"ל מדיה.
6. צנטריפוגה את תרחיף התא ב 271 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (RT) לתאי כדור.
7. השליכו את הסופרנאטנט על ידי שאיפה והשהו מחדש את גלולת התא במדיה כדי לקבל 3.0 x 10⁶ תאים למ"ל.
8. Aliquot 5 מ"ל של תאים ב 100 מ"מ x 20 מ"מ צלחות תרבית רקמה (כתשע מנות ישמשו; כמות התאים הכוללת בכל צלחת צריכה להיות ~ 15 x 10⁶).
9. השתמשו במנה אחת לשליטה/לא חשופה, ושאר הכלים יהיו חשופים לקרינת UV.
10. הגדר את קרוסלינקר UV לרמת האנרגיה הנכונה, לחץ על לחצן האנרגיה והזן "600" באמצעות המקלדת הנומרית, שהמכונה תקרא כ- 600 μJ / cm² x 100.
    הערה: יחידות אנרגיה UV crosslinker הם μJ / cm² x 100; לכן, כדי להשיג 60 מיליג'ול/ס"מ², המר יחידות כך שיתאימו לקרוסלינקר UV.
11. הקרינו את כל הכלים עם תאים, לא כולל הביקורת, ב 60 מיליג'ול (mJ) / ס"מ² באמצעות crosslinker UV. הסר את הכיסוי העליון של כלי תרבית הרקמה במהלך חשיפה לקרינת UV, מכיוון שאור UV לא יחדור את כיסוי הפלסטיק.
12. לדגור על כל הכלים באינקובטור תרבית תאים, כולל בקרה לא חשופה, ב 37 ° C ב 5% CO₂ במשך 4 שעות.
13. אשר אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה באמצעות ערכת זיהוי בדיקת אפופטוזיס המכילה annexin V ו- propidium iodide (PI) (סמנים לאפופטוזיס ונמק, בהתאמה) לאחר 4 שעות של דגירה, בהתאם להוראות היצרן.
    הערה: הקרנת תאי Jurkat T בקרוסלינקר UV ברמת אנרגיה של 600 μJ/cm², לאחר דגירה של 4 שעות תוביל לכך של-≥75% מהתאים האפופטוטיים (מוקדמים ומאוחרים כאחד) יהיו יותר פנוטיפ אפופטוטי מוקדם מאשר הפנוטיפ האפופטוטי המאוחר. זה מקל על מקרופאגים בנאדיות לזהות אותם ולבלוע אותם מכיוון שהקרומים שלהם אינם נפגעים, בניגוד לתאים אפופטוטיים מאוחרים, מה שמוביל לאינדקס אפרוציטי גבוה יותר והדמיה מדויקת יותר של אפרוציטוזה של מקרופאגים בנאדיות במחקר זה.
    1. בריכה 333 μL (1 x 10⁶ תאים) של תאי Jurkat T ממספר צלחות (הן "ללא UV" והן "חשופות UV") יחד לשימוש עבור צינורות ניתוח פיצוי.
    2. Aliquot 333 μL של תאי Jurkat T בכתם יחיד לא מוכתם, נספח V, כתם יחיד PI, ללא בקרת UV, ו 600 μJ / cm² צינורות ציטומטריית זרימה מסומנים UV.
    3. צינורות צנטריפוגות ב 188 x גרם במשך 5 דקות ב RT ו decant supernatant.
    4. יש לשטוף תאים על-ידי השעיה מחדש של 500 מיקרוליטר של מלח קר חוצץ פוספט (PBS).
    5. תאי צנטריפוגה וגלולה ב 188 x גרם במשך 5 דקות ב RT. להשליך את supernatant לאחר צנטריפוגה.
    6. הכינו 400 μL של חיץ קשירה 1x לכל צינור זרימה על ידי דילול חיץ קשירה 10x במים מזוקקים בזמן שהתאים נמצאים בצנטריפוגה.
    7. הכינו מגיב דגירה נספח V ו-PI (100 מיקרוליטר לדגימה/צינור) בהתאם להוראות היצרן.
    8. דקרו את הסופרנאטנט לאחר הצנטריפוגה והשעו בעדינות את כל הצינורות ב-400 מיקרוליטר של חיץ קשירה 1x, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של מגיב דגירה נספח V לכל צינור דגימה. לבסוף, הוסף 100 μL של כתם יחיד נספחין V וכתם יחיד PI לצינורות המתאימים, אך אל תוסיף דבר מעבר למאגר הקישור 1x לצינור הלא מוכתם.
    9. לדגור צינורות בחושך במשך 15 דקות ב RT.
    10. צנטריפוגה של כל התאים ב 188 x גרם במשך 5 דקות ב RT ו decant supernatant.
    11. להשהות מחדש תאים ב 400 μL של 1x מאגר קשירה, ולאחר מכן לנתח דגימות עבור אפופטוזיס על ידי ציטומטריה זרימה. לאסוף לפחות 10,000 אירועים לכל צינור כדי לאפשר ייצוג מדויק של הצביעה.
14. שלב את כל התאים המוקרנים מצלחות לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ותאי גלולה על ידי צנטריפוגה ב 271 x גרם במשך 5 דקות ב RT.
15. יש להשליך את הסופרנאטנט מהצינור על ידי שאיפה ולהשהות מחדש תאים ב-24 מ"ל של מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) ותאי גלולה באמצעות צנטריפוגה במהירות של 271 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
16. יש להשליך את הסופרנאטנט מהצינור על ידי שאיפה ולהשהות מחדש תאים בכמות PBS המשמשת למינון עכברים שאושרו על ידי IACUC. המינון המשמש הוא בין 5-10 x 10⁶ תאים / 50 μL לעכבר; לכן, עבור 10 עכברים, resuspend ב 500 μL (מספר התאים בכל מנה משתנה בהתאם כמה תאים הם בתרבית עבור הקרנה).
    הערה: הכינו לפחות שתי מנות נוספות כדי לקחת בחשבון כל נוזל שעלול להידבק לדפנות קצה הפיפטה, וכתוצאה מכך לאבד תאים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
ערכת V-FITC נספחית	טרוויגן	4830-250-K	ערכת TACS Annexin V-FITC מאפשרת זיהוי מהיר, ספציפי וכמותי של אפופטוזיס בתאים בודדים בעת שימוש בציטומטריית זרימה.
BCL2 Jurkat תאי T	ATCC	ATCC CRL-2899	קו תאי BCL2 Jurkat נגזר על ידי הדבקת תאי Jurkat T אנושיים עם וקטור ביטוי היונקים pSFFV-neo המכיל את החדרת BCL-2 ORF האנושית וגן עמיד לנאומיצין. היה עבור מודלים של מדידת efferocytosis.
מונה תאים אוטומטי של הרוזנת השנייה	תרמופישר	AMQAX1000	זוהי פלטפורמת בדיקה benchtop מצויד אופטיקה חדישה, פוקוס אוטומטי מלא, ותוכנת ניתוח תמונה להערכה מהירה של תאים בהשעיה. קל מאוד לשימוש.
ציטוספין 4 ציטוצנטריפוגה	תרמופישר	A78300003	מספק תכשירים חסכוניים בשכבה דקה מכל מטריצה נוזלית, במיוחד נוזלים היפותאיים כגון נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי.
סרום בקר עוברי, מוסמך, מנוטרל בחום	תרמופישר	16140071	מספק חומרים מזינים לתאים בתרבית כדי שהם יגדלו. זה סטנדרטי עבור תרבית תאים.
פניצילין-סטרפטומיצין	סיגמא/אולדריץ'	P0781-100ML	פניצילין-סטרפטומיצין הוא הפתרון האנטיביוטי הנפוץ ביותר לתרבית תאי יונקים. בנוסף, הוא משמש לשמירה על תנאים סטריליים במהלך תרבית תאים.
RPMI 1640 בינוני, תוסף GlutaMAX	תרמופישר	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) פותח במקור כדי לגדל תאים לוקמיים אנושיים בתרחיף וכחד-שכבתי. מדיום RPMI 1640 נמצא מאז מתאים למגוון תאי יונקים, כולל HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, אסטרוציטים וקרצינומה. עוזר לגדל תאי Jurkat T במהירות וביעילות.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker	קיימברידג' סיינטיפיק	16659	Stratalinker UV crosslinker נועד לגרום אפופטוזיס, crosslink DNA או RNA לניילון, nitrocellulose, או ניילון מחוזקים nitrocellulose ממברנות.