ניתוח הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה

תקציר

מקור: Doña, I. et al., Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis. J. Vis. Exp. (2021)

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבדיקה להערכת הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.

1. הכנת דוגמאות

1. יש לאסוף דם היקפי בצינורות הפריניזציה של 9 מ"ל ולשמור על הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) ברוטור עד שהיא נדרשת לפרוטוקול הניסוי.
2. תווית 5 מ"ל ציטומטר ציטומטר לבקרות שליליות (2 צינורות), בקרות חיוביות (2 צינורות) וריכוזים שונים של אלרגן/תרופה (צינורית אחת לכל אלרגן/ריכוז תרופה שנבדק). הניחו את הצינורות במדף שבו הצינורות מתאימים בצורה מושלמת מבלי להחליק.
3. יש להכין חיץ גירוי במים מזוקקים כפול המכילים 2% (v/v) HEPES, 78 מ"ג/ליטר NaCl, 3.7 מ"ג/ליטר KCl, 7.8 מ"ג/ליטר CaCl₂, 3.3 מ"ג/ליטר MgCl₂, 1 גרם/ליטר HSA. כוונן את רמת החומציות ל-7.4 והוסף IL-3 ב-2 ננוגרם/מ"ל. בדרך כלל, להכין 100 מ"ל ולחלק ל 2.5 מ"ל aliquots להיות קפוא ב -20 ° C.
4. הכן בקרות חיוביות ב- PBS-Tween-20 0.05% (v/v) (PBS-T): בקרה חיובית 1, N-Formyl methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (4 μM), כדי לאשר את איכות הבזופילים; בקרה חיובית 2, Anti-IgE (0.05 מ"ג/מ"ל) כבקרה חיובית בתיווך IgE.
5. הכינו את האלרגן/התרופה ב-PBS-T בריכוז הסופי פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי.
   הערה: ריכוזי אלרגן/תרופה אופטימליים לשימוש חייבים להיקבע בעבר על ידי שימוש בטווח רחב של ריכוזים, על ידי עקומות מנה-תגובה, ועל ידי מחקרי ציטוטוקסיות העוקבים אחר אותם שלבי פרוטוקול.

2. הכנת תערובת צביעה

1. הוסף נוגדנים חד שבטיים המסומנים בפלואורוכרום למאגר הגירוי לאחר ריכוז הנוגדנים המומלץ על ידי היצרן או על ידי טיטרציה קודמת של נוגדנים. בפרוטוקול זה, אנו מוסיפים 1 μL של כל נוגדן (CCR3-APC ו- CD203c-PE לזיהוי בזופילים; CD63-FITC להפעלת בזופילים) לכל 20 מיקרוליטר של מאגר גירוי.
   הערה: יש להגן על הכנת תערובת הצביעה מפני האור.
2. הוסיפו 23 מיקרוליטר של תערובת כתמים לכל צינור.

3. גירוי דם

1. הוסף 100 μL של PBS-T לצינורות 1 ו-2 (בקרה שלילית), 100 μL של fMLP לצינור 3, 100 μL של anti-IgE לצינור 4, ו-100 μL של ריכוזי אלרגנים/תרופות שונים לצינורות הבאים. לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C באמבטיה תרמוסטטית עם תסיסה בינונית כדי ריאגנטים prewarm.
2. הוסף בעדינות 100 μL של דם לכל צינור כדי למנוע המוליזה. מערבלים צינורות בעדינות ודגרים במשך 25 דקות ב 37 ° C באמבטיה תרמוסטטית עם תסיסה בינונית.
3. עצור את degranulation, שמירה על צינורות ב 4 ° C לפחות 5 דקות.
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ב 4 ° C למשך 30-45 דקות במידת הצורך.

4. אריתרוציטים שוכבים

1. הוסף 2 מ"ל של 1x חיץ lysing לכל צינור כדי ליז אריתרוציטים. מערבלים כל צינור ודגרים במשך 5 דקות ב- RT.
   הערה: בשלב זה, התאים קבועים עקב חומרים מקבעים (פורמלדהיד) הכלולים בחיץ.
2. צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. דקרו את הסופרנטנט והפכו את המתלה לכיור. תאים נשארים בתחתית הצינורות.
3. הוסף 3 מ"ל של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף תאים. מערבלים כל צינור.
4. צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. דקרו את הסופר-נטנט והפכו את המתלה לכיור.
   הערה: יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4°C, מוגנות מפני האור עד לרכישת ציטומטר זרימה.

5. רכישת ציטומטריה של זרימה

1. קבל דגימות על ידי ציטומטר זרימה (למשל, BD FACSCalibur Flow Cytometer). חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר (טבלה 1).
2. התחל רכישה לדוגמה.
3. השתמש באסטרטגיות הציטומטר הבאות לבחירת בזופילים פעילים.
   1. שער הלימפוציטים מחלקת פיזור הצד (SSC) - פיזור קדמי (FSC).
   2. שער הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3⁺CD203c⁺. לרכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור.
   3. הצג תרשים CCR3 - CD63 לניתוח ההפעלה באמצעות CD63 כסמן הפעלה. הגדר את הסף השלילי CD63 לכ -2.5% באמצעות צינורות הבקרה השליליים.
   4. לרכוש את כל הדגימות.

טבלה 1: דרישות ציטומטר זרימה

מקורות אור (לייזרים)	לייזר ארגון-יון מקורר אוויר SapphireTM בקוהרנטיות של 488 ננומטר; 20 mW; לייזר מקורר אוויר JDS UniphaseTM HeNe בגודל 633 ננומטר; 17 mW
אורך גל מעורר אור	לייזר כחול:488 ננומטר; לייזר אדום: 633 ננומטר
עוצמת מקור האור באורך הגל המעורר	לייזר כחול: 20 mW; לייזר אדום: 17 mW
מסננים אופטיים	ע"א 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20
גלאים אופטיים	FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, נגמ"ש FL4-H
גלאים אופטיים קושרים	לייזר ארגון-יון מקורר אוויר
נתיבים אופטיים	מתומן BD (קו לייזר 488 ננומטר); טריגונים BD (קו לייזר 633 ננומטר)

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5 מ"ל מבחנה תחתונה עגולה מפוליסטירן, ללא מכסה, לא סטרילית	קורנינג	352008
נוגדן CD193 נגד אדם (CCR3) APC	ביולג'נד	310708
BD FACSציטומטר זרימה של קליבור	BD Biosciences
סידן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	C1016
נוגדן CD63 אנטי אנושי FITC	ביולג'נד	353006
HEPES (1 מטר)	תרמו-פישר	15630106
תמיסת Lysing מרוכזת פי 10	BD Biosciences	349202
מגנזיום כלורי	סיגמא-אולדריץ'	M8266
N-Formyl-Met-Leu-Phe	סיגמא-אולדריץ'	F3506
נוגדן PE נגד אדם CD203c (E-NPP3)	ביולג'נד	324606
אשלגן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 9541
עכבר מטוהר IgE אנטי-אנושי	BD Biosciences	555857
רקומביננטי אנושי IL-3	מערכות מו"פ	203-IL
נוזל מעטפת	BD Biosciences	342003
נתרן כלורי	סיגמא-אולדריץ'	S3014
צינור 9 מ"ל LH ליתיום הפרין	גריינר ביו-וואן	455084
טווין 20	סיגמא-אולדריץ'	עמ' 1379