$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנת דוגמאות
- יש לאסוף דם היקפי בצינורות הפריניזציה של 9 מ"ל ולשמור על הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) ברוטור עד שהיא נדרשת לפרוטוקול הניסוי.
- תווית 5 מ"ל ציטומטר ציטומטר לבקרות שליליות (2 צינורות), בקרות חיוביות (2 צינורות) וריכוזים שונים של אלרגן/תרופה (צינורית אחת לכל אלרגן/ריכוז תרופה שנבדק). הניחו את הצינורות במדף שבו הצינורות מתאימים בצורה מושלמת מבלי להחליק.
- יש להכין חיץ גירוי במים מזוקקים כפול המכילים 2% (v/v) HEPES, 78 מ"ג/ליטר NaCl, 3.7 מ"ג/ליטר KCl, 7.8 מ"ג/ליטר CaCl2, 3.3 מ"ג/ליטר MgCl2, 1 גרם/ליטר HSA. כוונן את רמת החומציות ל-7.4 והוסף IL-3 ב-2 ננוגרם/מ"ל. בדרך כלל, להכין 100 מ"ל ולחלק ל 2.5 מ"ל aliquots להיות קפוא ב -20 ° C.
- הכן בקרות חיוביות ב- PBS-Tween-20 0.05% (v/v) (PBS-T): בקרה חיובית 1, N-Formyl methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) (4 μM), כדי לאשר את איכות הבזופילים; בקרה חיובית 2, Anti-IgE (0.05 מ"ג/מ"ל) כבקרה חיובית בתיווך IgE.
- הכינו את האלרגן/התרופה ב-PBS-T בריכוז הסופי פי 2 מהריכוז הסופי הרצוי.
הערה: ריכוזי אלרגן/תרופה אופטימליים לשימוש חייבים להיקבע בעבר על ידי שימוש בטווח רחב של ריכוזים, על ידי עקומות מנה-תגובה, ועל ידי מחקרי ציטוטוקסיות העוקבים אחר אותם שלבי פרוטוקול.
2. הכנת תערובת צביעה
- הוסף נוגדנים חד שבטיים המסומנים בפלואורוכרום למאגר הגירוי לאחר ריכוז הנוגדנים המומלץ על ידי היצרן או על ידי טיטרציה קודמת של נוגדנים. בפרוטוקול זה, אנו מוסיפים 1 μL של כל נוגדן (CCR3-APC ו- CD203c-PE לזיהוי בזופילים; CD63-FITC להפעלת בזופילים) לכל 20 מיקרוליטר של מאגר גירוי.
הערה: יש להגן על הכנת תערובת הצביעה מפני האור.
- הוסיפו 23 מיקרוליטר של תערובת כתמים לכל צינור.
3. גירוי דם
- הוסף 100 μL של PBS-T לצינורות 1 ו-2 (בקרה שלילית), 100 μL של fMLP לצינור 3, 100 μL של anti-IgE לצינור 4, ו-100 μL של ריכוזי אלרגנים/תרופות שונים לצינורות הבאים. לדגור במשך 10 דקות ב 37 ° C באמבטיה תרמוסטטית עם תסיסה בינונית כדי ריאגנטים prewarm.
- הוסף בעדינות 100 μL של דם לכל צינור כדי למנוע המוליזה. מערבלים צינורות בעדינות ודגרים במשך 25 דקות ב 37 ° C באמבטיה תרמוסטטית עם תסיסה בינונית.
- עצור את degranulation, שמירה על צינורות ב 4 ° C לפחות 5 דקות.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ב 4 ° C למשך 30-45 דקות במידת הצורך.
4. אריתרוציטים שוכבים
- הוסף 2 מ"ל של 1x חיץ lysing לכל צינור כדי ליז אריתרוציטים. מערבלים כל צינור ודגרים במשך 5 דקות ב- RT.
הערה: בשלב זה, התאים קבועים עקב חומרים מקבעים (פורמלדהיד) הכלולים בחיץ.
- צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. דקרו את הסופרנטנט והפכו את המתלה לכיור. תאים נשארים בתחתית הצינורות.
- הוסף 3 מ"ל של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף תאים. מערבלים כל צינור.
- צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4°C למשך 5 דקות. דקרו את הסופר-נטנט והפכו את המתלה לכיור.
הערה: יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4°C, מוגנות מפני האור עד לרכישת ציטומטר זרימה.
5. רכישת ציטומטריה של זרימה
- קבל דגימות על ידי ציטומטר זרימה (למשל, BD FACSCalibur Flow Cytometer). חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר (טבלה 1).
- התחל רכישה לדוגמה.
- השתמש באסטרטגיות הציטומטר הבאות לבחירת בזופילים פעילים.
- שער הלימפוציטים מחלקת פיזור הצד (SSC) - פיזור קדמי (FSC).
- שער הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+. לרכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור.
- הצג תרשים CCR3 - CD63 לניתוח ההפעלה באמצעות CD63 כסמן הפעלה. הגדר את הסף השלילי CD63 לכ -2.5% באמצעות צינורות הבקרה השליליים.
- לרכוש את כל הדגימות.
טבלה 1: דרישות ציטומטר זרימה
| מקורות אור (לייזרים) | לייזר ארגון-יון מקורר אוויר SapphireTM בקוהרנטיות של 488 ננומטר; 20 mW; לייזר מקורר אוויר JDS UniphaseTM HeNe בגודל 633 ננומטר; 17 mW |
| אורך גל מעורר אור | לייזר כחול:488 ננומטר; לייזר אדום: 633 ננומטר |
| עוצמת מקור האור באורך הגל המעורר | לייזר כחול: 20 mW; לייזר אדום: 17 mW |
| מסננים אופטיים | ע"א 488/10; FITC: 530/30, PE:585/42, APC: 660/20 |
| גלאים אופטיים | FSC, SSC, FL1-H FITC, FL2-H PE, נגמ"ש FL4-H |
| גלאים אופטיים קושרים | לייזר ארגון-יון מקורר אוויר |
| נתיבים אופטיים | מתומן BD (קו לייזר 488 ננומטר); טריגונים BD (קו לייזר 633 ננומטר) |