$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת מחטי מיקרו-הזרקה
- הכן מחטי הזרקה נימיות מזכוכית קיר דקה (1.0 OD/0.75 ID) באמצעות מכשיר מושך מיקרופיפטה עם ההגדרות הבאות: לחץ אוויר 200, חום 502, משיכה 90, מהירות 80, זמן 70, זמן אוויר בתחילת משיכה 5, זמן אוויר בסוף משיכה 5.
- בעזרת פינצטה עדינה, שברו את קצה המחט המשוכה כך שפתח החוד יהיה בקוטר של כ-10 מיקרומטר.
2. הכנת צלחות הזרקת זחל
- שוטפים מסרק ג'ל ברוחב נתיב של כ-4-5 מ"מ במים סטריליים ומניחים לו להתייבש.
- מכינים תמיסת אגרוז נמסה גבוהה 1.5-2% בתווך E3 ומחממים במיקרוגל עד שהתמיסה צלולה. לאחר שהתקרר, יוצקים מעט מהאגרוז לצלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) ומערבלים, מוסיפים מספיק אגרוז כדי לכסות לחלוטין את תחתית המנה.
- לאחר ששכבת האגרוז התמצקה, הניחו את מסרק הג'ל השטוף והמיובש מעליו כך שהקצה הלא מסורק פשוט מונח על החלק העליון של צלחת הפטרי והקצה המסורק נוגע באגרוז. יש לוודא שהמסרק אופקי ככל האפשר, תוך יצירת זווית של 30° ביחס לשכבת האגרוז התחתונה.
- יוצקים כמות קטנה נוספת של אגרוז בממשק שבין המסרק לשכבת האגרוז התחתונה כך ששכבת האגרוז הטרייה תכסה את בארות המסרק. מניחים להתקרר לחלוטין לפני הסרת המסרק. בעזרת קצה צינור, הסר את כל חתיכות האגרוז התלויות מהבארות.
- יוצקים את מדיום E3 על גבי תבנית ההזרקה ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
- לפני כל שימוש, יש להחליף ברמפות הזרקה טריות בינוניות וחמות בטמפרטורה של 28.5°C למשך שעה לפחות לפני ההזרקה.
- מיד לפני הזרקות, יש להחליף את ה-E3 שעל כבש ההזרקה בתווך E3 המכיל 200 מק"ג/מ"ל אתיל 3-אמינובנזואט (טריקאין).
3. הכנת סטרפטוקוקוס iniae (S. iniae) Inoculum
- מכינים ואוטוקלאבים מרק טוד יואיט בינוני בתוספת תמצית שמרים 0.2% ו-2% פרוטאוז פפטון (THY+P): 30 גרם/ליטר טוד יואיט, 2 גרם/ליטר תמצית שמרים, 20 גרם/ליטר פרוטאוז פפטון. לצלחות אגר, הוסיפו 14 גרם לליטר אגר.
- הכינו תרביות חיידקים בלילה שלפני ההדבקות על ידי הזרמה של 100 μl aliquot של מלאי חיידקים קפואים לתוך 10 מ"ל של ציר THY+P בצינור אטום של 15 מ"ל. לדגור לילה ללא תסיסה ב 37 °C (77 °F). לאחר 14-16 שעות של צמיחה, השתמשו בתרבית הלילה כדי להכין מלאי מקפיא או להתכונן לשימוש בזריקות.
- צור מלאי מקפיא על ידי הנחת 1 מ"ל של תרבית לילה ב 500 μl של 80% גליצרול בצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל. כדי למנוע מחזורי הקפאה-הפשרה, הכינו 100 μl aliquots חד-פעמיים מתערובת זו ואחסנו אותם בטמפרטורה של -80°C.
- עבור S. iniae המשמש בזיהומים, יש לדלל את תרבית הלילה ביחס 1:100 לקבלת נפח כולל של תרבית 10 מ"ל על ידי הוספת 0.1 מ"ל של תרבית לילה ל-9.9 מ"ל של ציר THY+P. לגדול ב 37 ° C ללא תסיסה במשך כ 4-5 שעות. נטר את הצפיפות האופטית (OD) ב- 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-דרופ וקצור את החיידקים בפאזה לוגריתמית אמצעית כאשר OD600 ננומטר מגיע ל- 0.250-0.500. OD600 ננומטר של 0.250 מתאים לכ-108 יחידות יוצרות מושבה (CFU)/מ"ל.
- גלולה 1 מ"ל של תרבית חיידקים בצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל ב 1,500 x גרם במשך 5 דקות. להשהות ב 1 מ"ל של מלח טרי חוצץ פוספט (PBS) וחוזר חלילה. מדוד את OD600 ננומטר של החיידקים ב- PBS, גלולה והשהיה מחדש ב- PBS כדי להשיג את הריכוז הרצוי.
- כדי לסייע בהדמיה של מיקרו-הזרקה, הוסף פנול אדום לתרחיפים החיידקיים לפני ההזרקה לקבלת ריכוז סופי של 0.1%.
- לניסויים הכוללים הזרקה של חיידקים מומתים בחום, חממו את החיידקים ב-PBS ב-95°C למשך 30 דקות. אשרו שתהליך הרג החום הפחית את מספר החיידקים בני קיימא לרמות בלתי ניתנות לגילוי על ידי ציפוי נפח הזרקה (כ-1 nl) על צלחות אגר מוצקות מסוג THY+P ודגירה למשך הלילה ב-37°C.
4. תיוג S. iniae בצבע פלואורסצנטי אדום של CellTracker
- כדי לתייג תאי חיידקים חיים, הכינו תמיסת מלאי של צבע פלואורסצנטי CellTracker או שווה ערך. מכיוון שהצבע המשמש מגיע ב 20 x 50 מיקרוגרם אליציטוטים של אבקה ויש להשהות אותו מחדש בדימתיל סולפוקסיד (DMSO), הוסף 7.3 μl DMSO לצינור כדי לקבל ריכוז מלאי של 10 mM.
- בדקו טווח של ריכוזי צבע (למשל, 0.5-25 מיקרומטר) על החיידקים כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי הנמוך ביותר שמכתים את התאים. תאים המתחלקים במהירות וניסויים ארוכים יותר עשויים לדרוש ריכוז גבוה יותר של צבע.
- גלולה 1.0 מ"ל תרבית חיידקים בצינור 1.7 מ"ל בצנטריפוגה כמתואר לעיל (סעיף 3). השהה מחדש את הגלולה ב- PBS טרי של 1 מ"ל והוסף את נפח הצבע המתאים לתרבית החיידקים.
- יש לדגור ללא תסיסה בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות. יש לסחרר את החיידקים ולהשהות מחדש ב-1 מ"ל של ציר THY+P שחומם מראש ולדגור ללא תסיסה למשך 30 דקות נוספות ב-37°C.
- סובבו את החיידקים ושטפו אותם פעמיים ב-PBS לפני מדידת OD600 ננומטר ודילול החיידקים למיקרו-הזרקה כמפורט לעיל (סעיף 3). בדרך כלל אנו מזריקים כ-100 CFU בנפח הזרקה של 1 nl עבור המחקרים שלנו על גיוס לויקוציטים ופאגוציטוזה.
5. הכנת זחלי דגי זברה לזיהומים
- הקימו זוגות רבייה בלילה הקודם ואספו עוברים כפי שתוארו על ידי רוזן ואחרים.לדגור על עוברים בתווך E3 בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להדבקה.
- עבור דגי זברה שיצולמו, למנוע התפתחות פיגמנט (מלניזציה) על ידי הוספת N-Phenylthiourea (PTU) למדיום E3 24 שעות לאחר ההפריה (hpf) לריכוז סופי של 0.2 ננומטר.
- עבור זיהומים המערבים עוברים בני יומיים לאחר ההפריה (dpf), עוברים dechorionate באופן ידני עם זוג פינצטה עדינה. לחילופין, יש לבצע דה-כוריונאט לעוברים על ידי הסרת E3 והחלפתם בפרונאז (2 מ"ג/מ"ל) למשך כ-5 דקות או עד שפיפטינג עדין מוציא את העוברים מהכוריון. רוב הזחלים היו צריכים לבקוע באופן טבעי עד 3 dpf.
- יש להרדים דגי זברה מספר דקות לפני ההדבקה על ידי הכנסת זחלים דכוריוניים למדיום E3 המכיל 200 מיקרוגרם/מ"ל טריקאין.
6. הזרקת שלפוחית Otic של S. iniae לזחלים בני שלושה ימים
- הפעל את המיקרו-מזרק והגדר את טווח הזמן ל"אלפית השנייה". פתח את השסתום במיכל הפחמן הדו-חמצני כדי לאפשר לגז להיכנס לקו. הלחץ של המיקרו-מזרק צריך לקרוא כ-20 פאונד לאינץ' מרובע (PSI). כוונן את הלחץ ביחידת המיקרו-מזרק על-ידי סיבוב בכיוון השעון של הידית השחורה להגברת הלחץ או סיבוב נגד כיוון השעון להפחתת הלחץ.
- מערבלים את תרבית S. iniae המוכנה בפנול אדום ו- PBS ומשתמשים בקצה מיקרו-מעמיס כדי לטעון 2-3 μl של התרבית לתוך מחט הזרקת נימים משוכה.
- הרכיבו את המחט הטעונה על מיקרומניפולטור המחובר למעמד מגנטי ומקמו אותה מתחת לסטריאומיקרוסקופ כך שהמחט תהיה בזווית של 45-65 מעלות ביחס לבסיס המיקרוסקופ.
- לחץ על דוושת כף הרגל של המיקרו-מזרק כדי לפזר טיפה של החיסון על קצה המחט. מדוד את קוטר הטיפה באמצעות סרגל קנה המידה בעדשת העין של המיקרוסקופ.
- לחלופין, להעריך את קוטר הטיפה על ידי הזרקת נפח לתוך טיפת שמן מינרלי על שקופית מיקרוסקופ זכוכית עם סרגל קנה מידה. קוטר הטיפה צריך להיות כ 0.10 מ"מ, שהוא בערך נפח 1 nl.
- התאם את גודל הטיפה על ידי התאמת הגדרת משך הזמן במזרק המיקרו או על ידי חיתוך חלק גדול יותר מקצה המחט בפינצטה עדינה. שים לב כי זמן ההזרקה צריך להיות בין 20 - 35 msec כדי למנוע גרימת נזק רב מדי לרקמות.
- בעזרת צינור העברה מפלסטיק מעבירים 12 זחלים מורדמים לכל באר של תבנית ההזרקה.
- השתמשו במוט זכוכית, לולאת שיער או קצה פלסטיק כדי למקם בעדינות את הזחלים כך שהראשים מופנים לכיוון החלק האחורי של המיקרוסקופ ושק החלמון צמוד לצד השמאלי של הבאר. כוונו את האוזן השמאלית של הזחל כלפי מעלה לכיוון התקרה.
- בהסתכלות דרך עדשת העין של הסטריאומיקרוסקופ, השתמש בידיות על המיקרומניפולטור כדי ליישר את המחט הטעונה עם שלפוחית העין כך ששניהם יהיו באותו שדה ראייה. נקב את שכבת האפיתל החיצונית של השלפוחית האופטית עם קצה המחט כך שקצה המחט נמצא ממש בתוך השלפוחית.
- לחץ על דוושת כף הרגל כדי להזריק 1 nl של המינון הרצוי של S. iniae. הקפד להשתמש בלחץ נמוך מספיק כדי לא לקרוע את החלל. אם ההזרקה מצליחה, השלפוחית האופטית, אך לא הרקמה שמסביב, אמורה להתמלא באינוקולום אדום פנול (איור 1 Ai). הסר מיד כל דג שהוחדר שלא כהלכה מצלחת ההזרקה.
- משכו בזהירות את המחט מהזחל והזיזו את צלחת ההזרקה ביד כך שהזחל הבא יהיה גלוי. בצע זאת תחת הגדלה של פי 5.
הערה: נסיגה של המחט עלולה לגרום לשקיעת חיידקים מסוימים מחוץ לשלפוחית האופטית, מה שעלול להטות את תוצאות ההישרדות וגיוס לויקוציטים. כדי להימנע מכך, מומלץ להזריק חיידקים עם תווית צבע פלואורסצנטי ולסרוק ויזואלית זחלים מוזרקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי להסיר את כל הזחלים שבהם זה קרה. זחל מוזרק כהלכה מוצג ב (איור 1 Bi).
- כדי להבטיח שנפח ההזרקה/החיסון יישאר זהה במהלך הניסוי, הזריקו טיפה של התרחיף החיידקי לתוך צינור צנטריפוגה של 1.7 מ"ל המכיל 100 מיקרוליטר PBS סטרילי לאחר כל עובר48. צלחת את 100 μl על לוחות אגר THY+P ב 37 ° C במשך הלילה כדי לקבוע את CFU בנפח ההזרקה.
- כאשר כל הקבוצה של 12 הזחלים על כבש ההזרקה הוזרקה, בזהירות להשתמש פיפטה העברת פלסטיק כדי להסיר את הזחלים מן הבארות ולהניח אותם לתוך צלחת פטרי חדשה (35 x 10 מ"מ2). הסר את תמיסת הטריקאין והחלף אותה בכ -2 מ"ל של מדיום E3 טרי כדי לאפשר לזחלים להתאושש.
- פיפט הזריק זחלים לבארות בודדות של צלחת בת 96 בארות ודגר בטמפרטורה של 28.5 מעלות צלזיוס. עקוב אחר הזחלים לאורך זמן להישרדות בלוחות אלה או הסר אותם מאוחר יותר לצורך הדמיה או ספירת CFU.
7. קיבוע זחלים לצורך הדמיה
- תקן זחלים בפרפורמאלדהיד 4% קר כקרח בתמיסת PBS כמתואר בסעיף 7.
- בטמפרטורת החדר, יש לשטוף 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחת ב-PBS לפני ההדמיה.
8. הכנת הזחלים להדמיה חיה
- הכינו תמיסת אגרוז בעלת נקודת התכה נמוכה של 1.5% ב-E3 על ידי חימום במיקרוגל עד שהתמיסה תהיה צלולה.
- הניחו את תמיסת האגרוז באמבט מים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לה להתקרר אך לא להתקשות.
- הוסף טריקאין לאגרוז לריכוז סופי של 0.016%.
- בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, מניחים 4-5 זחלים מורדמים בצלחת תחתית זכוכית על הבמה של סטריאומיקרוסקופ.
- הסר את תמיסת הטריקאין והאגרוז מאמבט המים בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס ותן לו להתקרר בטמפרטורת החדר למשך 1-2 דקות. בזמן שהאגרוז מתקרר, הוציאו כמה שיותר נוזלים מהזחלים המורדמים.
- יוצקים את האגרוז המקורר לתבשיל עד שכמחצית משטח מכוסה. מערבלים את המנה כדי להפיץ את האגרוז. שימו לב שאם האגרוז חם מדי, הוא יהרוג את הזחלים. כמו כן, אם מוסיפים יותר מדי אגרוז לצלחת, העדשה האובייקטיבית של המיקרוסקופ עלולה לפגוע בתחתית המנה בעת התמקדות דרך האגרוז.
- בעזרת פיפטת העברה, מרימים את הזחלים שצפו לדפנות המנה ומחזירים אותם למרכז.
- מתחת לסטריאומיקרוסקופ, מקמו בעדינות את הזחלים לפי הצורך בעזרת לולאת שיער, קצה פיפטה ארוך או מוט זכוכית. לצורך הדמיה של השלפוחית האוטית, מקם את הזחלים כך שהשלפוחית האופטית השמאלית שטוחה כנגד תחתית המנה.
- מצננים את האגרוז כ-10 דקות לפני שמזיזים את המנה. הזחלים עשויים לשנות מיקום אם האגרוז אינו מוצק. מזלפים בעדינות מעט טריקאין ותמיסת E3 לחלק העליון של שכבת האגרוז כדי לשמור על לחותה.
9. הדמיה קונפוקלית של זיהום
- הניחו את צלחת תחתית הזכוכית עם הזחלים על במה של מיקרוסקופ הפוך עם מערכת קונפוקלית לסריקת לייזר FV-1000.
- כוונו את חור הסיכה ל-200-300 מיקרומטר ובעזרת עדשה אובייקטיבית בעלת מפתח נומרי של 0.75/20X, קבעו ערימות z עם פרוסות של 3-6 מיקרומטר.
- השתמש בסריקת קו רציפה כדי להתאים את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי עבור כל ערוץ.
- באמצעות סריקת קו רציף עבור כל תעלה פלואורסצנטית (למשל, 488 ו- 543 ננומטר) וניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC), ערוך סרט בהילוך מהיר של השלפוחית האופטית השמאלית כל 3 דקות במשך 2-6 שעות כדי לצפות בגיוס ראשוני ופאגוציטוזה על ידי נויטרופילים ומקרופאגים. לקורסים ארוכים יותר, הניחו מכסה על צלחת הפטרי כדי למנוע אידוי והתייבשות של האגרוז.
- רכשו תמונות סטילס של זחלים קבועים (איור 1B) או חיים (איור 2) בהגדלה של פי 20 או 40.
10. פוטו-המרה של לויקוציטים מסומנים Dendra2 בשלפוחית האוטית
הערה: ניתן להמיר את Dendra2 מפלואורסצנטיות ירוקה לאדומה על ידי מיקוד לייזר 405 ננומטר (עוצמת לייזר של 50-70% אמורה להספיק) באזור העניין (ROI) למשך דקה אחת. להלן פרוטוקול שלב אחר שלב המשמש למערכת קונפוקלית לסריקת לייזר FV-1000:
- הצג את הדגימה באופן חזותי באמצעות סריקת z-stack עם לייזרים של 488 ננומטר ו- 543 ננומטר. השתמש בסריקת קו רציפה כדי לכוונן את עוצמת הלייזר ואת רווח הגלאי. בדוק כדי לוודא שאין פלואורסצנטיות אדומה שהומרה בטעות.
- בחלון "בקרת רכישת תמונות", תחת "הגדרת גירוי" בחר בכלי "השתמש בסורק" ובחר "ראשי". בחר את מדפסת הלייזר 405 ננומטר והגדר אותה להספק של 70%. באמצעות אפשרות המעגל, הגדר את החזר ההשקעה בשלפוחית האופטית.
- תחת "הגדרת התחלת גירוי" בחר "הפעלה בסדרה" עם הפעלה מוקדמת של מסגרת אחת וזמן הפעלה של 60,000 מילישנייה. בחלון "הגדרת רכישה" תחת הכותרת "סריקת זמן", בחר 2 מרווחי זמן של 00:01:00 (אחד עבור לפני ואחד עבור המרה שלאחר הצילום).
הערה: לאחר השלמת סריקת סדרת קיטועי הזמן, ה- Dendra2 היה אמור לעבור פוטו-המרה למצב הפלואורסצנטי האדום שלו.
- סרוק את הדגימה על-ידי ערימת z באמצעות לייזרים של 488 ננומטר ו-543 ננומטר כדי להמחיש את הפלואורסצנטיות האדומה המומרת בפוטו, כמו גם כל פלואורסצנטיות ירוקה שנותרה (איור 3).
