1. ציטומטריית זרימה ומיון תת-סוגים של לימפוציטים
הערה: מיון לימפוציטים בהתאם לסוג התא חיוני לביסוס תוויות סוג התא של אמת קרקעית (כלומר, נכונה) כדי לאמן ולבדוק מסווג סוג תא בלמידה מפוקחת. ציטומטריית זרימה, שיטת תקן זהב, משמשת לזיהוי והפרדה של לימפוציטים.
- צור תערובת של נוגדנים לצביעת סמן פני השטח ב- 100 μL של RPMI-1640 בינוני טרי [עם 10% FBS, 0.1 מיקרוגרם של CD3e (17A2), CD8a (53-6.7), CD19 (1D3), CD45R (B220, RA3-6B2) ו- NK1.1 (PK136)] ו- 0.25 מיקרוגרם של נוגדני CD4 (GK1.5) כדי להתמקד בלימפוציטים מסוג B, CD4+ T ו- CD8+ T.
- הוסף 100 μL של תערובת נוגדנים להשעיית התא.
- יש לדגור במשך 25 דקות על קרח.
- לשטוף את התאים על ידי הוספת 5 מ"ל של PBS וצנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, פעמיים.
- להשהות מחדש את גלולת התא ב 5 מ"ל של RPMI-1640 בינוני טרי עם 10% FBS ו 2.5 מיקרוגרם של DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole).
- אסוף כל סוג לימפוציטים בנפרד עם ציטומטריית זרימה באמצעות רמות הפלואורסצנטיות של הסמנים שתוארו לעיל. להוציא בו-זמנית תאים מתים באמצעות אותות DAPI.
2. 3D דימות פאזה כמותי
- שמור את הלימפוציטים ממוינים על קרח לאורך כל הליכי ההדמיה, אשר יש להשלים בתוך 5 שעות (מאז בידוד לימפוציטים מהעכבר) כדי למנוע נזק לתאים ושינויים ביוכימיים.
- בחר סוג תא ממוין (בין לימפוציטים B, CD4+ T ו- CD8+ T) ודלל את הדגימה ל- 180 תאים/μL עם מדיום RPMI לתנאי הדמיה אופטימליים (כלומר, תא אחד לכל שדה ראייה יחיד).
- טען 120 μL של הדגימה המדוללת לתוך תא הדמיה על ידי הזרקה איטית. בדוק היטב את נוכחותן של בועות בתא ההדמיה עם הדגימה. אם יש בועות, בזהירות להסיר אותם, כפי שהם יפגעו באיכות המדידות.
- רכוש טומוגרפיות 3D RI באמצעות מיקרוסקופ פאזה כמותי תלת-ממדי מסחרי, או הולוטומוגרפיה, ותוכנת ההדמיה שלו.
הערה: מידע מפורט על מערך הניסוי ניתן למצוא בכתב היד המקורי.
- מניחים טיפת מים מזוקקים על גבי עדשת האובייקט של המיקרוסקופ.
- הניחו את תא ההדמיה עם הדגימה על במת התרגום של המיקרוסקופ והתאימו את מיקומה כך שהדגימה תתיישר עם עדשת המטרה.
- התאם את מיקומי הצירים של עדשות המטרה והמעבה על ידי לחיצה על פוקוס ומשטח, בהתאמה, בכרטיסייה "כיול" בפרספקטיבה "מיקרוסקופ" של תוכנת ההדמיה.
- יישרו את עדשות המטרה והמעבה בלחיצה על 'מצב אוטומטי'. לחלופין, השתמש במצב סריקה וכוונן ידנית את העדשות כך שתבניות התאורה ימוקמו באזור המרכזי של שדה הראייה.
- חזור למצב רגיל והתאם את שלב התרגום כדי לאתר תא בשדה הראייה.
- מצא את מישור המוקד על ידי התאמת המיקום הצירי של עדשת האובייקט. מיקוד מושלם הופך את גבול הדגימה המוצג על המסך לכמעט בלתי נראה.
- התאם את שלב התרגום כדי למצוא מיקום ללא תא.
- לחץ על כיול כדי למדוד הולוגרמות דו-ממדיות מרובות עם זוויות תאורה משתנות.
- התאם את שלב התרגום כדי לאתר תא במרכז שדה הראייה.
- עבור לכרטיסייה "רכישה" ולחץ על 3D Snapshot כדי למדוד את ההולוגרמות של התא עם זוויות הארה זהות כפי שנעשה בשלב 2.4.8.
- כאשר הנתונים שנרכשו מוצגים בלוח "ניהול נתונים", לחץ לחיצה ימנית על הנתונים שנרכשו ולחץ על תהליך כדי לשחזר טומוגרפיית RI תלת ממדית מההולוגרמות שנמדדו בשלבים 2.4.8 ו- 2.4.10, באמצעות אלגוריתם טומוגרפיית העקיפה המיושם בתוכנת ההדמיה.
- חזור על שלבים 2.4.5-2.4.11 כדי למדוד יותר מ- 100 תאים כדי להבטיח עוצמה סטטיסטית עבור למידת מכונה.
- ניתן להציג באופן חזותי את כל התמונות המעובדות באמצעות שלב 2.4.11. בחלונית "ניהול נתונים", לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הנתונים ולחץ על פתח כדי להמחיש את הנתונים. לחץ על RI Tomogram בחלונית "Data Manager". בכרטיסייה "הגדרה מוגדרת מראש", לחץ על טען ולחץ פעמיים על "lymphocyte.xml", שהיא פונקציית העברה מוגדרת מראש המסופקת על ידי תוכנת ההדמיה כדי להמחיש את הטומוגרפיה על פי הפצות RI תלת מימדיות.
- חזור על שלבים 2.2-2.4 כדי למדוד טומוגרפיות RI תלת-ממדיות של כל תת-סוגי הלימפוציטים.
