כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון
1. איסוף דם מחולים
זהירות: יש לנקוט באמצעי בטיחות מתאימים במעבדה בעת איסוף דם מלא מהמטופל. יש ללבוש כפפות ומשקפיים. אם המטופל נמצא בבידוד, אנא עקוב אחר נהלי בטיחות ביולוגית ברמה 4.
- כדי לאסוף דם שלם תוך ורידי מהמטופל, השתמש במחט פרפר עם צינורות מאריכים קטנים ובשפופרת ואקום לאיסוף דם המכילה חיץ ליזה/קשירה. הניחו את זרוע המטופל במצב כלפי מטה ומקמו את צינור האיסוף נמוך יותר ממחט הפרפר. הכנס את מחט הפרפר לווריד המטופל וחבר את צינור הוואקום לאיסוף הדם לשלוחה הקטנה.
הערה: פעולה זו תמנע זרימה חוזרת.
- לאחר איסוף הדם, מערבבים את תוכן הצינור על ידי הפיכת הצינור 5 - 10 פעמים.
הערה: בשל הוואקום שנותר בצינור איסוף הדם המכיל 1.6 מ"ל של ליזה/חיץ קשירה, נפח הדגימה שנאספה יהיה אוטומטית 1.6 מ"ל.
- יש לחטא את החלק החיצוני של הצינור באמצעות אתנול 70%.
- לדגור על הצינורות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ואת צינורות איסוף הדם המלאים ניתן לאחסן ב -20 ° C, 5 ° C, 25 ° C או 37 ° C למשך חודש אחד לפחות.
- המשך ישירות לשיטת מיצוי NA פשוטה.
2. מיצוי NA מפושט של הדם כולו
- כדי לטהר את NA מהדם שנאסף על ידי ליזיס/חיץ קשירה, יש לערבב את תכולת הצינור על ידי הפיכת שפופרת הוואקום ביד 5 - 10x.
- הסר את מכסה הצינור בזהירות ופרוק את המכסה.
- יוצקים את aliquot מוכן של MGPs (1 מ"ל) ישירות לתוך צינור איסוף הדם.
- הניחו מכסה חדש מצינורית איסוף דם שאינה בשימוש על הצינורית המכילה את הדגימה.
- הנח אצבע על המכסה כדי להבטיח שהצינור סגור היטב וערבב את תוכן הצינור על ידי הפיכת צינור איסוף הדם ביד 5 - 10 פעמים.
- הניחו את הצינור במחזיק המגנטי והשאירו אצבע על המכסה כדי לוודא שהצינור סגור היטב.
- הפוך את המחזיק המגנטי עם הצינור כמה פעמים ביד כדי לוודא שכל ה- MGPs נאספים בצד הצינור עם המגנט.
הערה: ניתן להחליף את המחזיק המגנטי במגנט מוארך ובגומייה.
- הסר את מכסה הצינור והשלך את תכולת הצינור באמצעות פיפטה חד פעמית או פשוט על ידי מזיגת התוכן לתוך צינור איסוף 50 מ"ל.
הערה: הימנע מאירוסולים מצינור האיסוף של 50 מ"ל על ידי סגירת הצינור עם מכסה.
- יוצקים את aliquot מוכן של לשטוף buffer-1 (WB-1, 4 מ"ל) ישירות לתוך צינור איסוף הדם.
- הניחו את המכסה על הצינור והניחו אצבע על המכסה כדי לוודא שהצינור סגור היטב.
- הסר את הצינור מהמחזיק המגנטי, תוך שמירה על המכסה מהודק היטב באמצעות אצבע.
הערה: אם אתם משתמשים במגנט ובגומייה, פשוט הסירו את הגומייה והמגנט מהשפופרת.
- Resuspend את MGPs על ידי הפיכת צינור איסוף הדם ביד 5 - 10 פעמים.
- חזור על שלבים 2.6 - 2.8.
- יוצקים את aliquot מוכן של WB-2 (1.5 מ"ל) ישירות לתוך צינור איסוף הדם.
- הניחו את המכסה על הצינור והוציאו את הצינור מהמחזיק המגנטי.
הערה: אם אתם משתמשים במגנט ובגומייה, פשוט הסירו את הגומייה והמגנט מהשפופרת.
- הניחו אצבע על המכסה כדי לוודא שהצינור סגור היטב.
- השהה מחדש את ה- MGPs על ידי הפיכת צינור איסוף הדם למשך מספר שניות ביד.
- חזור על שלבים 2.6 - 2.8.
- יוצקים את aliquot מוכן של WB-3 (3 מ"ל) ישירות לתוך צינור איסוף הדם.
- הניחו את המכסה על הצינור והוציאו את הצינור מהמחזיק המגנטי.
הערה: אם אתם משתמשים במגנט ובגומייה, פשוט הסירו את הגומייה והמגנט מהשפופרת.
- הניחו אצבע על המכסה כדי לוודא שהצינור סגור היטב.
- Resuspend את MGPs על ידי הפיכת צינור איסוף הדם ביד 5 - 10 פעמים.
- חזור על שלבים 2.6 - 2.8.
- יוצקים את aliquot מוכן של חיץ elution (EB, 100 μL) ישירות לתוך צינור איסוף הדם.
- הניחו את המכסה על הצינור והוציאו את הצינור מהמחזיק המגנטי.
הערה: אם אתם משתמשים במגנט ובגומייה, פשוט הסירו את הגומייה והמגנט מהשפופרת.
- השהה מחדש את ה- MGPs ב- EB על ידי הקשה על צינור איסוף הדם 5 - 10 פעמים עם אצבע.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן, וניתן לאחסן את הצינורות ב -20 מעלות צלזיוס.
- העבר טיפה אחת (5 - 8 μL) של MGPs מרחפים מחדש לתערובת תגובת ההגברה של NA במורד הזרם באמצעות פיפטה חד פעמית של 1.5 מ"ל (ניתן להשתמש בכל בדיקת הגברת NA אבחנתית במורד הזרם, כגון הגברה איזותרמית בתיווך לולאה (LAMP)/ מנורת שעתוק לאחור (RT-LAMP) או תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR)/RT-qPCR assas).
הערה: ה-NAs ידבקו ל-MGPs, לכן הקפידו להשתמש ב-MGPs בתגובת ההגברה במורד הזרם. יש לערבב את מתלה MGP לפני השימוש. לאחר הערבוב, MGPs ייאספו בתחתית הצינור.
