$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. הכנת ליפוזומים
- חשב את כמות תמיסות מלאי תלויות כלורופורם של 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ו- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-cap biotinyl (Biotin-PE) כדי ליצור מלאי מדולל בריכוז הסופי הרצוי. כדי להגיע לריכוזים סופיים של 400 מיקרומטר DOPC ו-80 מיקרומטר ביוטין-PE פוספוליפידים ב-10 מ"ל כל אחד, יש להתחיל בהצבת 629 מיקרוליטר של 10 מ"ג/מ"ל DOPC ו-88 מיקרוליטר 10 מ"ג/מ"ל ביוטין-PE בצינורות כרומטוגרפיית זכוכית נפרדים.
הערה: חשוב לנקות מזרקי המילטון זכוכית ושפופרות כרומטוגרפיה זכוכית על ידי תמיסת ניקוי (1 ליטר 95% אתנול ל 120 מ"ל מים המכילים 60 גרם אשלגן הידרוקסיד, KOH) תוך העברת תמיסת מלאי מרחפת כלורופורם של DOPC וביוטין-PE.
- יבשו את הכלורופורם עם זרם של ארגון במכסה המנוע הכימי. אוטמים את צינור הכרומטוגרפיה עם פרפילם.
- יש להעביר את הליפוזומים שזה עתה יובשו לוואקום גבוה בליופיליזר למשך הלילה (O/N) כדי להסיר שאריות כלורופורם. להשלמה באותו יום, יש לייבש למשך 60-90 דקות.
- בזמן שהליופיליזר פועל, הכינו חיץ דילול. עבור פרוטוקול זה, להכין 25 מ"ל המורכב של 25 mM Tris, pH 8.0; 150 mM NaCl; ו-2% (לפי משקל) n-octyl-β-D-glucopyranoside (OG) דטרגנט. ערבבו תחילה את שני המרכיבים הראשונים יחד, ולאחר מכן החליפו את החמצן בארגון לפני הוספת אבקת OG היבשה. לאחר ההכנה, סננו את תמיסת OG עם קרום תאית אצטט 0.2 מיקרון, ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
- בנוסף, הכינו שני בקבוקים מברגים של 1 ליטר חיץ טריס-מלח באותם ריכוזים, אך ללא OG. הניחו מוט ערבוב מגנטי מזוקק במים בתחתית כל אחד מהם. מכינים 6 ליטרים נוספים של חיץ טריס-מלוחים. הוציאו חמצן מכל הבקבוקים עם ארגון והניחו אותם גם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- לאחר ליופיליזציה, ממיסים את השומנים המיובשים במאגר Tris-מלוחים OG כדי ליצור תמיסה של 4 mM מכל אחד. בהתאם לאמצעי האחסון לדוגמה, הוסף 2 מ"ל לצינור DOPC ו-0.2 מ"ל לצינור Biotin-PE.
- ערבבו את שומני הביוטין-PE עם הליפידים של DOPC. זה משפר את הניידות של SLB, כמו ביוטין מצומד יכול לפגוע בנזילות של קבוצות ראש פוספט. כדי להגיע לריכוז סופי של 80 מיקרומטר ביוטין-PE, יש לערבב 0.2 מ"ל של 4 מ"מ ביוטין-PE ו-1 מ"ל של 4 מ"מ DOPC. לאחר מכן להוסיף 8.8 מ"ל של חיץ Tris-מלוחים OG.
- לקבלת ריכוז סופי של 400 μM DOPC, פשוט לערבב 1 מ"ל של 4 mM DOPC עם 9 מ"ל של Tris-מלוחים OG.
- מלאו את הסוניקטור במי קרח. שים את צינור הזכוכית המכיל את phospholipid מדולל במרכז הסוניקטור באמצעות מהדק השירות. סוניק את הפוספוליפיד המדולל במשך 10 דקות עד שהתמיסה מתבהרת.
הערה: הוסיפו קרח לאמבט המים הסוניקטור כדי לשמור על טמפרטורה נמוכה מכיוון שסוניקציה תיצור חום.
- ממלאים את הצינורות בארגון כדי להזיז את החמצן באוויר את הנוזל, ואוטמים אותם בפרפילם.
2. דיאליזה של ליפוזומים
- יש לחתוך מהגליל שני חלקים של צינורות דיאליזה יבשים (חיתוך משקל מולקולרי: 12-14,000, קוטר: 6.4 מ"מ) באורך מתאים (בדוגמה זו, 40 ס"מ), אחד לכל דילול פוספוליפידים.
- הרטיבו מחדש את חלקי הצינור על ידי כך שתאפשרו להם להשרות 200 מ"ל מים מזוקקים בכוס זכוכית למשך 2 דקות.
- חממו אותו במיקרוגל במשך 5 דקות במצב גבוה, או לפחות עד שהמים מגיעים לרתיחה.
- קשרו קשר בקצה אחד של כל צינור ושטפו את החלק הפנימי בכמה מיליליטרים של חיץ Tris-מלוחים-OG. לאחר מכן, סחטו בקפדנות כמה שיותר ממאגר הכביסה הזה כדי למזער את כמות החיץ שנותרה בפנים.
- במכסה מנוע זרימה למינרית, מוסיפים את הפוספוליפידים המדוללים לכל צינור ומהדקים את הקצוות הפתוחים עם סגירת צינור דיאליזה קטנה כדי להוציא את כל האוויר. אי הכללת אוויר מלאה תדרוש הקרבה של נפח קטן של הדגימה על ידי הידוק מתחת ל"קו המים".
- לטבול את הדגימות בבקבוקים מוכנים מראש של חיץ Tris-מלוחים ללא OG. יש להחליף את החמצן בבקבוק בארגון לפני האיטום מחדש ולערבב את ה-O/N בטמפרטורה של 4°C.
- העבירו את הצינורית לבקבוק חדש של חיץ טריס-מלח ללא OG כל 12 שעות למשך 3 פעמים לפחות.
- זמן קצר לפני הסרת השומנים החוגגים, הכינו מספר צינורות קטנים שאליהם ניתן לנעול את השומנים על ידי מילוי כל אחד מהם בארגון כדי לעקור את החמצן.
- לאחר 36 שעות, קחו את בקבוקי הדיאליזה לתוך מכסה המנוע של הזרימה הלמינרית והוציאו את צינורות הדיאליזה מהבקבוקים. יש חיתול ספסל או בהישג יד כדי לאסוף את הנגר הרטוב.
- חותכים את צינורות הדיאליזה מעל האטב, ואז מסירים את הקליפ ומעבירים בזהירות את תמיסת השומנים המחויגים באמצעות פיפט לאליציטוטים של 1 מ"ל בצינורות מוכנים מראש מלאים בגז ארגון על קרח.
- Aliquot את תמיסת הליפוזומים המימית, ולהשתמש בזרם הארגון כדי להזיז חמצן שוב בכל צינור.
- אחסנו את הליפוזומים בטמפרטורה של 4°C. אין להקפיא.
3. בידוד וטיפוח תאי NK אנושיים
- Aliquot 15 מ"ל דם היקפי או מעיל באפי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. יש לדלל דם זה במי מלח חוצצי פוספט (PBS) המכיל 1% נסיוב בקר עוברי (FBS) ביחס של 1:1.
- מוסיפים 13 מ"ל של פיקול בעדינות לתחתית הצינור עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל.
- צנטריפוגה צינור זה למשך 20 דקות במהירות של 1,200 x גרם עם דוושת ההאצה והניתוק או בהגדרות הנמוכות ביותר שלהם.
- לאחר הצנטריפוגה, השתמשו בפיפט סרולוגי כדי לאסוף את השכבה האמצעית הלבנה העכורה של תאי הדם החד-גרעיניים ההיקפיים (PBMCs), שאמורה לשבת ואת ההצטלבות בין שכבה עליונה צהובה שקופה לשכבה תחתונה בהירה יותר, שתיהן יושבות מעל שכבה תחתונה של תאי דם אדומים (RBCs). הערה: אל תאסוף RBCs כלשהם באיסוף PBMCs.
- הניחו את ה-PBMCs שנאספו בצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל, ודיללו לקיבולת עם PBS המכיל 1% FBS. שוב צנטריפוגה, הפעם עם הבלם ודוושת ההאצה לכל היותר, למשך 5 דקות ב-300 x גרם.
- השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של PBS המכיל 1% FBS.
- ספור את התאים בעת צנטריפוגה פעם נוספת באותן הגדרות כמו בשלב 3.6.
- השליכו את הסופרנאטנט פעם נוספת, והשהו מחדש את התאים בתווך R10 בצפיפות של 10 מיליון תאים/מ"ל.
- קח 30 מיליון תאים בשפופרת פוליסטירן של 5 מ"ל, ובודד תאי NK באמצעות ערכת הפרדה מגנטית, בהתאם להוראות היצרן. לאחר הבידוד, ספרו את התאים פעם נוספת והשהו מחדש בצפיפות של 500,000 תאים/מ"ל בתווך R10 שלם (88% Roswell Park Memorial Institute medium, RPMI; 10% FBS; 1% N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid, HEPES; 1% נתרן פירובט) בתוספת IL-2 (100 U/ml). תרבית ב 37° בחממת CO2 ולהחליף בינוני 2-3 פעמים בשבוע.
4. הרכבת שכבת השומנים המישורית הנתמכת בזכוכית
- הכן תמיסת פיראנה 100 מ"ל על ידי ערבוב 30% מי חמצן עם חומצה גופרתית ביחס של 1:3 בכוס.
הערה: בצע תמיד עבודה עם חומרים מזיקים כמו חומצה גופרתית במכסה אדים כימי ייעודי כראוי.
- לתוך פתרון זה, לטבול 2 מלבניים #1.5 מכסה בתמיסת פיראנה במשך 20-30 דקות.
הערה: חיוני לנקות את הכיסויים עם תמיסת פיראנה.
- בזמן ניקוי הכיסויים, יש ליטול שפופרת אחת של שומנים 400 μM DOPC שהוכנו בעבר ושפופרת אחת של שומנים 80 μM Biotin-PE שהוכנו בעבר. העבירו אותם על קרח למיכל הארגון.
- החלף חמצן בצינור מיקרוצנטריפוגה חדש עם ארגון, ולאחר מכן חבר יחד את DOPC וביוטין-PE ביחס של 1:1. הנפח הספציפי ישתנה בהתאם לצרכי הניסוי, אך צריך להיות לפחות 2 μl כל אחד. החליפו את החמצן בצינור התערובת פעם נוספת עם גז ארגון, וגם בצינורות מגיבים בודדים, לפני שתחזירו את האחרון למקרר.
- לאחר סיום הניקוי, שטפו היטב את הכיסויים במים מזוקקים. הניחו את הכיסויים לייבוש באוויר למשך מספר דקות.
- משכו 1.5 מיקרוליטר מתערובת הליפוזומים שהוכנה בשלב 5.4 והכניסו אותה בטיפה אחת לאחד מתאי הנתיבים של מגלשת התא. השימוש ב-2 ירידות לכל נתיב הוא אופייני, אך אינו הכרחי.
- הניחו במהירות וביעילות את הכיסוי היבש על הטיפות. ודא שהטיפות מרווחות מספיק כדי שלא יתמזגו לאחר הנחת הכיסוי. יתר על כן, יש לוודא שהטיפות נשארות עגולות ומוגדרות היטב, מבלי לגעת בשולי קירות החדר. לחץ בחוזקה כלפי מטה בין ומסביב לכל נתיב כדי להבטיח אטימה למים בין הכיסוי למגלשה.
- סמן את מיקומי הטיפות באמצעות עט טוש.
- מעבירים 100 μl של קזאין מימי 5% דרך התא כדי לחסום את הדו-שכבתי. נסו לוודא שאין בועות בתא הזרימה.
- יש להזריק 100 μl של סטרפטאווידין בריכוז של 333 ננוגרם/מ"ל לכל נתיב. יש לדגור במשך 10-15 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לאחר מכן, יש לשטוף על ידי הזרמת 3 מ"ל של מלח חוצץ HEPES-Buffered Saline (HBS)/1% אלבומין בסרום אנושי (HSA) דרך כל נתיב כדי להסיר את עודפי הסטרפטווידין.
- הוסף 100 μl של biotinylated פלואורסצנטית מסומן אנטי CD16 כגון Alexa Fluor 568 בריכוז חלבון שנקבע בעבר כיעיל ביותר. דוגרים בחושך במשך 20-30 דקות. יש לשטוף שוב על ידי הזרמת 3 מ"ל HBS/1% HSA בכל נתיב.
- זרימה של 100 μl של D-ביוטין בריכוז של 25 ננומטר דרך התא על מנת לקשור כל עודף סטרפטאווידין ובכך לחסל את הסיכוי של קשירה לא ספציפית של סטרפטאווידין לתאים.
- יש לספור תאי NK ולהשהות מחדש בריכוז של 500,000/ml ב-HBS/1% HSA.
- תוך כדי סיבוב התאים, שטפו את ה-D-ביוטין אל מחוץ לתא עם עוד 3 מ"ל של HBS/1% HSA לכל נתיב.
- בדוק את הניידות של ליגנדות על SLB על ידי התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching (התאוששות פלואורסצנטית לאחר photobleaching, FRAP) על פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מלאה (TIRF) או מיקרוסקופ קונפוקלי לפני הוספת תאי NK.
- לאחר שהתאים סיימו להסתובב והושעו מחדש בריכוז הרצוי, הוסף 100 μl לכל נתיב.
- מניחים את התא באינקובטור CO2 של 37° 5% למשך 30-60 דקות.
- לאחר תקופת דגירה זו, תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde ב RT במשך 10-20 דקות. לשטוף על ידי הפעלת 3 מ"ל של PBS דרך כל נתיב כדי להסיר את paraformaldehyde.
- הוסף חיץ חוסם 400 μl (5% סרום חמור רגיל ו 0.2% Triton X-100 ב- PBS). יש לדגור ב-RT למשך 30 דקות.
- יש לצבוע F-אקטין ופרפורין על ידי הוספת 200 μl של פלואידין מדולל עם תווית פלואורסצנטית (יחידה אחת / מ"ל המסומנת כפלואדין) ונוגדן חד שבטי אנטי-פרפורין עם תווית פלואורסצנטית (500 ng/ml אנטי-פרפורין mAb). לדגור ב-RT למשך שעה.
- יש לשטוף על ידי הפעלת 3 מ"ל של PBS. התא מוכן להדמיה.
5. הדמיה של סינפסת NK על דו-שכבתית ליפידית באמצעות STED
- הפעל את כל מודולי החומרה הדרושים.
- הפעל את תוכנת ניתוח התמונה. הפעל הן סריקת תהודה והן מודולי STED. לאחר ביצוע בחירות אלה, המתן כ- 3-5 דקות להפעלת התוכנה.
- לחץ על הכרטיסייה "תצורה" בחלק העליון של המסך.
- בחר "תצורת לייזר" ולאחר מכן הפעל את האור הלבן ואת לייזר STED 592 ננומטר.
- בחר את המטרה 100x, ויישר את קרן לייזר העירור עם לייזר דלדול 592 ננומטר.
- בחר את מודול "תצורת לייזר", כבה את לייזר הדלדול 592 והפעל את לייזר דלדול 660 ננומטר.
- הניחו את המגלשה על הבמה, מעל העדשה. הביאו את התאים הקשורים לאזור הדו-שכבתי המסומן למיקוד באמצעות מנורת האור הלבנה והאוקולרים.
- חזור לכרטיסייה "רכישה", ישירות מימין לכרטיסייה "תצורה".
- לחץ על הכרטיסייה "עבור לאור לבן", ולאחר מכן הפעל מודול זה וגרור את קו לייזר העירור לאורך הגל המתאים.
- בחר את הגלאי הרצוי מרשימת הגלאים הזמינים, ולאחר מכן הגדר את טווח הגילוי כך שיכלול את הטווח המתאים של אורכי גל.
הערה: לעולם אל תניח את טווח הגילוי ישירות מתחת לקרן העירור.
- לחץ על כפתור "Seqential" בסרגל הכלים השמאלי "Acquire" כדי להעלות את תיבת הדו-שיח Sequential Scanning בתחתית סרגל הכלים השמאלי. זה מאפשר למשתמש להוסיף רצפים מרובים, כל אחד עם קרן עירור שונה עבור צבע אחר. לחץ על "בין מסגרות" ולאחר מכן הגדר את תדירות העירור, הגלאי וטווח הזיהוי עבור כל צבע נוסף כמו בשלבים 5.9 ו- 5.10.
- לאחר שכל ההגדרות מותאמות, לחץ על "התחל" כדי להתחיל בתהליך הרכישה.