בדיקת ציטוטוקסיות של תאי הרג טבעיים הכנת דגימה לניתוח ציטומטרי זרימה

תקציר

מקור: McBride, J. E., et al. ניתוח ציטומטרי של זרימה של פעילות ליטית של תאי הרג טבעיים בדם מלא אנושי. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים את הפעילות הליטית של תאי הרג טבעיים כנגד תאי מטרה מוכתמים פלואורסצנטית. השיטה מאפשרת מדידת ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תאי NK על ידי צביעת תאים מתים ושימוש בציטומטר זרימה לכימות תאי מטרה חיים ומתים.

פרוטוקול

1. הכנת בקרות

1. העבר את הפריטים הבאים לצינורות נפרדים המסומנים כראוי בנפח 1.5 מ"ל:
   1. הוסף 500 μL של IMDM טרי המכיל תאי K562 עם תווית DiO מרחפת לצינור "חיובי כפול" המסומן 1.5 מ"ל.
   2. הוסף 500 μL של IMDM טרי המכיל תאי K562 עם תווית DiO מרחפת לצינור "DiO בלבד" המסומן 1.5 מ"ל.
   3. הוסף 500 μL של IMDM טרי המכיל תאי K562 מרחפים ללא תווית לתוך "Propidium יודיד (PI) בלבד" המסומן 1.5 מ"ל צינור.
2. הניחו את הצינורות Double Positive ו-PI-only באמבט מים בטמפרטורה של 55°C למשך 5 דקות.
3. לאחר שחלפה 5 דקות, הסר את הצינורות ונגב אותם עם 70% אתנול.
4. הוסף 10 ליטר של PI לצינורות החיוביים הכפולים ו- PI רק 1.5 מ"ל.
5. מקם את כל שלושת פקדי תאי המטרה K562 באינקובטור בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
6. לאחר שחלפו 30 דקות הדגירה, צנטריפוגה את כל שלושת פקדי תאי המטרה K562 למשך 2 דקות במהירות של 163 x גרם.
7. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
8. השהה מחדש כל בקרה עם 20 μL של מדיה טרייה של תרביות תאי IMDM, והשאר באינקובטור 37 ° C עם 5% CO₂ למשך 30 דקות לפחות לאות DiO אופטימלי.
   הערה: הפקדים מוכנים כעת להפעלה דרך ציטומטר זרימת ההדמיה.

2. בדיקת ציטוטוקסיות הכנת מדגם

1. הכינו ותייגו שפופרות 1.5 מ"ל לכל דגימה/משתתף בהתאם.
2. פיפטה רצתה את היחס בין תאי NK ותאי K562 המסומנים ב- DiO בכל צינור.
   הערה: לדוגמה, היחס הרצוי בין תאי יעד K562 ותאי אפקט NK הוא 1:5.
3. צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 135 x גרם.
4. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
5. השהה מחדש תערובת תאי K562 עם תווית NK-DiO ב- 500 μL של מדיה של תאי NK ללא אינטרלוקין-2 (IL-2) ו- 2-מרקפטואתנול (2-ME) (מדיה לא שלמה של תרבית תאי NK).
   הערה: המדיה החלקית של תרבית תאי NK היא Minimum Essential Medium Eagle עם סודיום ביקרבונט, ללא L-גלוטמין, ריבונוקלאוזידים ודאוקסיריבונוקלאוזידים.
6. הוסף 5 μL של PI לכל צינור.
7. צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 163 x גרם.
8. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 2 שעות.
9. לאחר דגירה של שעתיים, צנטריפוגה למשך 2 דקות במהירות של 163 x גרם.
10. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
11. תאי השהיה מחדש במדיה של תרבית תאי NK לא שלמה של 25 μL.

3. הכנת מדגם ספונטני ("S")

1. פיפטה 500 μl של תאי K562 המסומנים ב- DiO (ריכוז של 1 x 106 תאים / מ"ל) לתוך צינור 1.5 מ"ל.
2. הוסף 10 μL של PI לכל צינור.
3. צינור צנטריפוגה למשך 2 דקות ב 163 x גרם.
4. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 2 שעות.
5. לאחר דגירה של שעתיים, צנטריפוגה למשך 2 דקות במהירות של 163 x גרם.
6. הסר בזהירות את הסופרנאטנט מבלי להפריע לכדורית התא.
7. תאי השהיה מחדש במדיית תרבית תאים חלקית של 25 μl אלפא-מינימום חיוני בינוני (α-MEM).

4. איסוף נתונים באמצעות ציטומטר זרימת הדמיה

1. לחץ על הכפתור הירוק בתוך הדלת הקדמית של ציטומטר זרימת ההדמיה כדי להפעיל את המכשיר.
2. הפעל את כל המחשבים המשויכים לציטומטר זרימת ההדמיה.
3. הפעל את תוכנת ציטומטר זרימת ההדמיה.
4. לחץ על כפתור "הפעלה" כדי לשטוף את המערכת ולהכין את שורת המדגם.
5. לאחר השלמת "הפעלה", סגור את החלון "כיולים".
6. הקצה ערוצים: בצד שמאל למעלה, לחץ על כל ערוץ כדי להקצות אותם.
7. בצד ימין, לחץ על כפתור תרשים הפיזור כדי ליצור 4 חלקות פיזור: Raw Max Pixel _MC_6 מול Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 מול Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 מול Area_M05 ו-FieldArea_M01 מול AspectRatio_M01.
8. התחל לנתח דגימות על ידי שימוש תחילה בפקד "חיובי כפול".
   1. לחץ על "טען".
   2. מקם את הצינור בנפח 1.5 מ"ל עם הדגימה "חיובית כפולה" משלבים 1.4 עד 1.8 לתוך מעמיס הדגימה.
   3. בחר את המטרה 40X תחת הכרטיסייה "הגדלה".
   4. הפעל את הלייזרים 405 mW ו- 642 mW.
   5. הפעל את ערוץ "Brightfield".
   6. לחץ על "בחר עוצמה".
   7. בהתבסס על דגימת הבקרה "חיובית כפולה", קבע את העוצמה הרצויה עבור לייזר 405 mW כך שהגלאי לא יהיה עמוס יתר על המידה.
      הערה: לדוגמה, העוצמה האופטימלית לניסוי זה נקבעה על 11 mW.
9. לאחר השגת ההגדרה הרצויה, רכוש נתונים.
   1. תחת הכרטיסייה "רכישת קבצים", הזן טקסט שם קובץ מותאם אישית. בחר תיקייה לשמירת קובצי הנתונים.
   2. הזן את מספר התאים שיש לרכוש לצד "אסוף". בדרך כלל מספר זה נע בין 1,000 ל-10,000.
   3. לחץ על "Acquire."
      הערה: לאחר רכישת מספר התאים הרצוי, קובץ הנתונים נשמר באופן אוטומטי בתיקיה הקודמת.
10. לאחר סיום הרכישה, טען את דוגמת הבקרה הבאה – בקרת DiO בלבד.
    1. לחץ על "טען".
    2. מקם את הצינור 1.5 מ"ל עם הדגימה "DiO בלבד" לתוך מטעין הדגימה.
    3. השאר את היעד 40X תחת הכרטיסייה "הגדלה" מסומנת.
    4. השאר את הלייזר 405 mW מופעל.
    5. כבה את הלייזר של 642 mW ואת ערוץ "Brightfield".
       הערה: כעת, לאחר שהושגה ההגדרה הרצויה, ניתן לרכוש נתונים.
    6. תחת הכרטיסייה "רכישת קבצים", הזן טקסט שם קובץ מותאם אישית ובחר תיקייה לשמירת קבצי הנתונים. הזן את מספר התאים שיש לרכוש לצד "אסוף". בדרך כלל מספר זה הוא 1,000.
    7. לחץ על "Acquire."
       הערה: לאחר רכישת מספר התאים הרצוי, קובץ הנתונים נשמר אוטומטית בתיקייה הקודמת שנבחרה.
11. חזור על שלב 4.10 עבור דוגמת הבקרה "PI בלבד". דגימות הניסוי מוכנות כעת לאיסוף.
12. טפל בדגימות הניסוי הנותרות, כולל "דגימות 'S' ספונטניות" באופן הבא:
    1. השאר את היעד 40X תחת הכרטיסייה "הגדלה" מסומנת.
    2. הפעל את הלייזרים של 405 mW ו- 642 mW.
    3. הפעל את ערוץ "Brightfield".
    4. לחץ על "הגדר עוצמה".
    5. תחת הכרטיסייה "רכישת קבצים", הזן טקסט שם קובץ מותאם אישית ובחר תיקייה לשמירת קבצי הנתונים. הזינו מלל מותאם אישית בשם הקובץ.
    6. הזן את מספר התאים שיש לרכוש לצד "אסוף".
    7. לחץ על כפתור "Acquire".
       הערה: לאחר רכישת מספר התאים הרצוי, קובץ הנתונים נשמר אוטומטית בתיקייה הקודמת שנבחרה.
13. חזור על שלב 4.12 עבור כל דגימות הניסוי.
14. לאחר שכל הנתונים והקבצים הניסיוניים נאספו, לחץ על כפתור "כיבוי" כדי לעקר את המערכת.

5. ניתוח דוגמת ציטומטר זרימת הדמיה

1. פתח את יישום התוכנה לניתוח ציטומטר זרימת הדמיה.
2. תחת "קובץ", פתח ניסוי. קובץ RIF.
3. בנה מטריצה חדשה באמצעות צבע יחיד. קובצי RIF (פקד DiO בלבד ופקד PI בלבד, שנוצרו במהלך שלבים 4.10 ו- 4.11) על-ידי בחירה באפשרות "צור מטריצה חדשה" תחת הכרטיסיה פיצוי בתוכנת ציטומטר זרימת ההדמיה.
   הערה: התוכנה תבקש את הבחירה של קבצי צבע יחיד ולמזג אותם כדי ליצור קובץ מטריצה (סיומת קובץ .ctm), כי הוא ייבחר להחיל פיצוי ערוץ.
4. צור חלקות נקודה באמצעות הפונקציה "אבני בניין" של התוכנה.
   1. צור תרשים נקודה (BrightFieldGradient_RMS לעומת תדירות) כדי לשער את התאים הממוקדים. קראו לשער "פוקוס" (איור 1A).
   2. באמצעות השער "מיקוד", צור תרשים נקודה של שטח שדה בהיר לעומת יחס גובה-רוחב של שדה בהיר כדי לשער את התאים הבודדים. קראו לשער "יחיד" (איור 1B).
   3. באמצעות השער "יחיד", צרו תרשים נקודות של Intensity_MC_Ch02 לעומת Intensity_MC_Ch5. השתמשו בתרשים הזה כדי לזהות ולשער תאים חיוביים DiO בלבד (מטרות, חיים) ותאים חיוביים כפולים PI-DiO (מטרות, מתים) (איור 1C).
      הערה: ניתן ליצור את כל החלקות המתוארות בשלבים 5.4.1, 5.4.2 ו- 5.4.3 באמצעות הפונקציה "אבני בניין" של התוכנה.
5. לחץ על פונקציית הסטטיסטיקה של תרשים הנקודות כדי לגשת למספרי התאים של כל שער.
6. חשב את אחוז המטרות המתות במדגם הספונטני ובדגימות הניסוי באמצעות הנוסחה הבאה:
   % מטרות מתות במדגם = (#dead מטרות x 100)/(#live מטרות + #dead מטרות)
7. חשב ציטוטוקסיות באמצעות הנוסחה הבאה:
   % ציטוטוקסיות = [(מת ניסיוני-מת ספונטני)/(100-מת ספונטני)]x100

תוצאות

איור 1: היסטוגרמות מייצגות, תרשימי פיזור ותמונות לניתוח פעילות ציטוטוקסית. (A) ניתוח תאי מיקוד. (B) אנליזה של תא בודד. (C) ניתוח צביעת תאי מטרה. כל ההחלטות מתקבלות באמצעות התמונה המצורפת לכל אירוע. ניתן לגשת לכך בתוכנת ניתוח פשוט על ידי לחיצה על האירוע בגרפים. (D) תמונה מייצגת של אירוע כפול, המראה תא NK אפופטוטי ומטרה חיה K562. Ch01,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
K-562 לימפובלסטים	ATCC	CCL-243
המדיה של Dulbecco של Iscove	ATCC	30-2005	גלוקוז גבוה, עם L-גלוטמין, עם HEPES, מסונן סטרילי
אלפא מינימום מדיום חיוני	ATCC	CRL-2407	ללא ריבונוקלאוזידים ודאוקסיריבונוקלאוזידים אך עם 2 מילימטר L-גלוטמין ו-1.5 גרם/ליטר נתרן ביקרבונט
Propridium יודיד פתרון צביעה	BD Pharmingen	51-66211E
פתרון Vybranto DiO לעיצוב תוויות תאים	ויברנטו	V-22886
ImageStream X סימן II הדמיה זרימה ציטומטר
דם מלא CD56 MicroBeads, אנושי	Miltenyi ביוטק	130-090-875
ImageStream X סימן II הדמיה זרימה ציטומטר	EMD Millipore
חרוזי מהירות	חברת אמניס	400030
תוכנת INSPIRE	EMD Millipore	גרסה סימן II, ספטמבר 2013
תוכנת יישום רעיונות	EMD Millipore		גרסה 6.1, יולי 2014