כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנה כללית של PCLS אנושי וחשיפה לאחר מכן לכימיקלים
הערה: שני אנשים נדרשים למלא ריאה. מומלץ לבצע רישום חיסונים עדכני לצהבת A ו-B. חולים נבדקים באופן שגרתי עבור HCV ו- HIV לפני השתלת ריאות. אם זיהום פעיל עם שחפת Mycobacterium מאובחן או חשוד, הריאה צריכה להידחות. עם זאת, יש להתייחס לכל רקמת הריאה האנושית הטרייה ולדגימות הנגזרות ממנה כמדבקות פוטנציאליות, ולנקוט באמצעי הגנה מתאימים (מסכות מסנן חלקיקים (FFP2), משקפי מגן, כפפות) כדי להבטיח את הבטיחות התעסוקתית של הצוות. ההליך אורך 60 - 90 דקות.
- לאשר את שלמות אונת הריאה האנושית.
הערה: קרע בצדר מונע מילוי הומוגני של הרקמה. חומר הריאה האנושי חייב להיות מיום הכריתה. תקופות אחסון של כשעתיים בטמפרטורת החדר (RT) לפני מילויו באגרוז על קרח נסבלות. הרקמה בה אנו משתמשים בפרוטוקול זה מתקבלת מחולים העוברים כריתה. זה לא מחולים שנפטרו. אם הרקמה אוחסנה על קרח, חממו אותה מראש ל-RT לפני מילויה, אחרת, האגרוז יתפלמר מיד, ולא תתאפשר סתימה הומוגנית.
זהירות: יש לוודא שכל האנשים הבאים במגע עם חומר אנושי מקומי לובשים בגדי מגן המורכבים ממעיל מעבדה, שני זוגות כפפות, כובע, מסכת פנים וזוג משקפי בטיחות. חומר אנושי עלול להיות מדבק.
- שוקלים 7.5 גרם של אגרוז ג'ל נמוך ומוסיפים אותו 250 מ"ל של מים מזוקקים. מרתיחים את האגרוז במיקרוגל עד להמסת האגרוז. מצננים אותו לכ-40°C, בהתאם לנקודת ההתכה והג'ל של האגרוז.
הערה: מספר צלוחיות נדרשות, בהתאם לגודל האונה.
- יש לחמם מראש ולשמור על מדיום התרבית (טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C.
הערה: אם האגרוז חם מדי, ויטמינים במדיום התרבית יאבדו מיעילותם והתאים ייפגעו. אם הטמפרטורה של התמיסה הבינונית/אגרוזית נמוכה מ-37°C, תהליך הג'לינג יתחיל ויפגע במילוי ההומוגני של הריאה. מומלץ רק טווח טמפרטורות של 37°C עד 39°C.
- יש להניח את כל החומרים הדרושים בהישג יד לפני שמתחילים: 5-10 מלחציים, קטטר גמיש באורך של כ-1 מ', מזרק מתאים (למשל, 50 מ"ל) המתאים לחיבור לצנתר, וקופסת קרח מלאה בקרח.
- מקננים את קנה הנשימה/סימפונות ראשיים על ידי החדרת צינור הסיליקון וקיבוע שלו עם מהדק בכיוון מקביל לצינור, כך שהמהדק לוחץ את הרקמה יחד לצד צינור הסיליקון מבלי לצבוט אותה. ודא שצינור הסיליקון מקובע פנימה ואינו יכול להחליק החוצה במהלך הליך המילוי. סגור את כל הסמפונות האחרים, כלי הדם והפציעות עם מלחציים, כך שאף אגרוז לא יכול לדלוף החוצה במהלך הליך המילוי.
- מערבבים נפח שווה ערך של אגרוז 3% ג'ל נמוך עם מדיום תרבית בכד. להחדיר את התערובת לתוך הריאה באמצעות מזרק 50 מ"ל. לפני מילוי המזרק במדיום, סגרו את הצנתר באצבעות או מהדק כדי למנוע בועות אוויר וריפלוקס אגרוז. ממלאים את אונת הריאה עד שהיא מנופחת לחלוטין. בזהירות לגעת בצדר הריאה בצד; הצדר צריך להיות אחיד וקשה.
הערה: בהתאם לגודל של אונת הריאה, עד 2 או 3 L של אגרוז / פתרון בינוני יכול להידרש.
- חזור על שלבים 1.5 - 1.6 עבור כל סימפונות במקרה של כמה סימפונות בתוך דגימה אחת.
- שים את הריאה על קרח פילמור של agarose לג'ל במשך 20 - 40 דקות, בהתאם לכמות agarose החדרת. בזהירות לגעת הצדר מכמה צדדים כדי לבדוק אם זה קשה וקריר, המציין כי פילמור הושלם, אחרת, להמשיך לחכות. תנו לפתולוגים לחתוך את הריאה לפרוסות, לקחת את הדגימות שלהם ולאחסן את חומר הריאה על קרח להובלה.
- חותכים את רקמת הריאה האנושית ללוחות של 3 - 5 ס"מ בעזרת סכין חדה.
הערה: השתמש בלהב חדש לכל ריאה כדי להבטיח חדות.
- מלאו את פרוסת הרקמה בתמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) במינון 400 מ"ל קרה כקרח. חתכו מיד ליבות רקמה גלילית מלוחות הריאה באמצעות מברג חצי אוטומטי עם כלי קורינג בקוטר המועדף (למשל, 8 מ"מ; 10 מ"מ).
הערה: קוטר זה חייב להיות שווה לקוטר מחזיק הרקמה בתוך המכונה.
- התאימו את עובי פרוסות הריאה לערך העובי הרצוי.
הערה: עובי של כ-250 מיקרומטר משמש בדרך כלל בניסויי PCLS. היצרן של חותך הרקמה ממליץ על מד עובי פרוסת הרקמה שלהם לאימות עובי הפרוסה. לחלופין, ניתן להשתמש בצביעה בהרכבה שלמה בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבוע את עובי הפרוסה.
- העבר את ליבות הרקמה למחזיק הרקמה של כלי הפריסה של הרקמות. שים את המשקל (חלק ממחזיק הרקמה) על גבי ליבת הרקמה. הגדר את מהירות הזרוע ואת מהירות הלהב ל- 6 בכלי הפריסה של הרקמות. התחל לחתוך את ליבת הרקמה לתוך PCLS.
- תוספת 500 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM): תערובת חומרים מזינים F-12 DMEM/F12 (1:1) עם 5 מ"ל פניצילין (10,000 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל). אחסנו את מדיום התרבית למשך מספר ימים בתנאים סטריליים במקרר. לחמם מראש רק את הנפח הנדרש של המדיום.
הערה: פניצילין יושבת אם יישמר בטמפרטורה של 37°C לתקופות ארוכות יותר. השתמשו במדיום תרבית ללא סרום וללא צבע, מכיוון שהרכב הסרום משתנה מאצווה לאצווה, וצבעים, כגון אדום פנול, עלולים להפריע לבדיקות.
- ממלאים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם 25 מ"ל מדיום תרבית קר כקרח. יש לנקז את המדיום מפרוסת הרקמה לתוך על ידי פתיחת מהדק גליל הזכוכית. מעבירים את הפרוסות מהכוס לצלחת הפטרי בעזרת תרבית בעזרת אפליקטור (למשל, לולאת חיסון). הכניסו את צלחת הפטרי לאינקובטור (37°C, 5% CO2, 100% לחות). תנו למדיום להתחמם לפני שלבי הכביסה.
הערה: כל השלבים הנוספים מבוצעים בתנאים סטריליים.
- הכניסו מסננת תאים לצלחת הפטרי לשטיפת PCLS. הסר לחלוטין את מדיום התרבית עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל דרך מסננת התא והוסף 25 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס מחומם מראש מדיום טרי. חזור על שלב זה 3 - 4 פעמים כל 30 דקות.
הערה: מסננת התאים מונעת מהפרוסות להישאב לתוך הפיפטה, כדי למנוע נזק לפרוסות.
- מעבירים בזהירות את פרוסות הריאה לצלחת תרבית של 24 בארות עם מינימום של 500 μL תרבית בינונית עבור שתי פרוסות לכל באר.
הערה: לצורך ההעברה, רצוי להשתמש בלולאת חיסון ולתת לפרוסות לצוף על הלולאה על מנת למנוע נזק לרקמות. אין צורך בהפרדה נוספת של הפרוסות, שכן רק מחסור במדיום טרי מספיק יגרום למוות תאי בפרוסות הרקמה. פרוסות יכולות לחפוף או לגעת זו בזו בבאר: אין לכך השפעה על כדאיות הרקמות.
