כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות IRB של המכון.
1. הכנה כללית של פרוסות ריאה חתוכות במדויק אנושי (PCLS) וחשיפה לאחר מכן לכימיקלים
הערה: שני אנשים נדרשים למלא ריאה. מומלץ לבצע רישום חיסונים עדכני לצהבת A ו-B. חולים נבדקים באופן שגרתי עבור וירוס הפטיטיס C (HCV) ווירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) לפני השתלת ריאות. אם זיהום פעיל עם שחפת Mycobacterium מאובחן או חשוד, הריאה צריכה להידחות. עם זאת, יש להתייחס לכל רקמת הריאה האנושית הטרייה ולדגימות הנגזרות ממנה כמדבקות פוטנציאליות, ולנקוט באמצעי הגנה מתאימים (מסכות מסנן חלקיקים (FFP2), משקפי מגן, כפפות) כדי להבטיח את הבטיחות התעסוקתית של הצוות. ההליך אורך 60 - 90 דקות.
- לאשר את שלמות אונת הריאה האנושית.
הערה: קרע בצדר מונע מילוי הומוגני של הרקמה. חומר הריאה האנושי חייב להיות מיום הכריתה. תקופות אחסון של כשעתיים בטמפרטורת החדר (RT) לפני מילויו באגרוז על קרח נסבלות. הרקמה בה אנו משתמשים בפרוטוקול זה מתקבלת מחולים העוברים כריתה. זה לא מחולים שנפטרו. אם הרקמה אוחסנה על קרח, חממו אותה מראש ל- RT לפני מילויה, אחרת, האגרוז יתפלמר מיד, ולא יתאפשר מילוי הומוגני.
זהירות: יש לוודא שכל האנשים הבאים במגע עם חומר אנושי מקומי לובשים בגדי מגן המורכבים ממעיל מעבדה, שני זוגות כפפות, כובע, מסכת פנים וזוג משקפי בטיחות. חומר אנושי עלול להיות מדבק.
- שוקלים 7.5 גרם של אגרוז ג'ל נמוך ומוסיפים אותו 250 מ"ל של מים מזוקקים. מרתיחים את האגרוז במיקרוגל עד להמסת האגרוז. מצננים אותו לכ-40°C, בהתאם לנקודת ההתכה והג'ל של האגרוז.
הערה: מספר צלוחיות נדרשות, בהתאם לגודל האונה.
- יש לחמם מראש ולשמור על מדיום התרבית (טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C.
הערה: אם האגרוז חם מדי, ויטמינים במדיום התרבית יאבדו מיעילותם והתאים ייפגעו. אם הטמפרטורה של התמיסה הבינונית/אגרוזית נמוכה מ-37°C, תהליך הג'לינג יתחיל ויפגע במילוי ההומוגני של הריאה. מומלץ רק טווח טמפרטורות של 37°C עד 39°C.
- יש להניח את כל החומרים הדרושים בהישג יד לפני שמתחילים: 5-10 מלחציים, קטטר גמיש באורך של כ-1 מ', מזרק מתאים (למשל, 50 מ"ל) המתאים לחיבור לצנתר, וקופסת קרח מלאה בקרח.
- מקננים את קנה הנשימה/סימפונות ראשיים על ידי החדרת צינור הסיליקון וקיבוע שלו עם מהדק בכיוון מקביל לצינור, כך שהמהדק לוחץ את הרקמה יחד לצד צינור הסיליקון מבלי לצבוט אותה. ודא שצינור הסיליקון מקובע פנימה ואינו יכול להחליק החוצה במהלך הליך המילוי. סגור את כל הסמפונות האחרים, כלי הדם והפציעות עם מלחציים, כך שאף אגרוז לא יכול לדלוף החוצה במהלך הליך המילוי.
- מערבבים נפח שווה ערך של אגרוז 3% ג'ל נמוך עם מדיום תרבית בכד. להחדיר את התערובת לתוך הריאה באמצעות מזרק 50 מ"ל. לפני מילוי המזרק במדיום, סגרו את הצנתר באצבעות או מהדק כדי למנוע בועות אוויר וריפלוקס אגרוז. ממלאים את אונת הריאה עד שהיא מנופחת לחלוטין. בזהירות לגעת בצדר הריאה בצד; הצדר צריך להיות אחיד וקשה.
הערה: בהתאם לגודל של אונת הריאה, עד 2 או 3 L של אגרוז / פתרון בינוני יכול להידרש.
- חזור על שלבים 1.5 - 1.6 עבור כל סימפונות במקרה של כמה סימפונות בתוך דגימה אחת.
- שים את הריאה על קרח פילמור של agarose לג'ל במשך 20 - 40 דקות, בהתאם לכמות agarose החדרת. בזהירות לגעת הצדר מכמה צדדים כדי לבדוק אם זה קשה וקריר, המציין כי פילמור הושלם, אחרת, להמשיך לחכות. הפתולוגים יחתכו את הריאה לפרוסות, ייקחו את הדגימות שלהם ויאחסנו את חומר הריאה על קרח להובלה.
- חותכים את רקמת הריאה האנושית ללוחות של 3 - 5 ס"מ בעזרת סכין חדה.
הערה: השתמש בלהב חדש לכל ריאה כדי להבטיח חדות.
- מלאו את פרוסת הרקמה בתמיסת מלח מאוזנת של ארל (EBSS) במינון 400 מ"ל קרה כקרח. חתכו מיד ליבות רקמה גלילית מלוחות הריאה באמצעות מברג חצי אוטומטי עם כלי קורינג בקוטר המועדף (למשל, 8 מ"מ; 10 מ"מ).
הערה: קוטר זה חייב להיות שווה לקוטר מחזיק הרקמה בתוך המכונה.
- התאימו את עובי פרוסות הריאה לערך העובי הרצוי.
הערה: עובי של כ-250 מיקרומטר משמש בדרך כלל בניסויי PCLS. היצרן של חותך הרקמה ממליץ על מד עובי פרוסת הרקמה שלהם לאימות עובי הפרוסה. לחלופין, ניתן להשתמש בצביעה בהרכבה שלמה בשילוב עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לקבוע את עובי הפרוסה כמתואר על ידי Brismar et al.
- העבר את ליבות הרקמה למחזיק הרקמה של כלי הפריסה של הרקמות. שים את המשקל (חלק ממחזיק הרקמה) על גבי ליבת הרקמה. הגדר את מהירות הזרוע ואת מהירות הלהב ל- 6 בכלי הפריסה של הרקמות. התחל לחתוך את ליבת הרקמה לתוך PCLS.
- תוספת 500 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של Dulbecco (DMEM): תערובת חומרים מזינים F-12 DMEM/F12 (1:1) עם 5 מ"ל פניצילין (10,000 יחידות/מ"ל) וסטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם/מ"ל). אחסנו את מדיום התרבית למשך מספר ימים בתנאים סטריליים במקרר. מחממים מראש רק את הנפח הנדרש של המדיום.
הערה: פניצילין יושבת אם יישמר בטמפרטורה של 37°C לתקופות ארוכות יותר. השתמשו במדיום תרבית ללא סרום וללא צבע, מכיוון שהרכב הסרום משתנה מאצווה לאצווה, וצבעים, כגון אדום פנול, עלולים להפריע לבדיקות.
- ממלאים צלחת פטרי (100 x 15 מ"מ) עם 25 מ"ל מדיום תרבית קר כקרח. יש לנקז את המדיום מפרוסת הרקמה לתוך על ידי פתיחת מהדק גליל הזכוכית. מעבירים את הפרוסות מהכוס לצלחת הפטרי בעזרת תרבית בעזרת אפליקטור (למשל, לולאת חיסון). הכניסו את צלחת הפטרי לאינקובטור (37°C, 5% CO2, 100% לחות). תנו למדיום להתחמם לפני שלבי הכביסה.
הערה: כל השלבים הנוספים מבוצעים בתנאים סטריליים.
- הכניסו מסננת תאים לצלחת הפטרי לשטיפת PCLS. הסר לחלוטין את מדיום התרבית עם פיפטה סרולוגית 10 מ"ל דרך מסננת התא והוסף 25 מ"ל של 37 מעלות צלזיוס מחומם מראש מדיום טרי. חזור על שלב זה 3 - 4 פעמים כל 30 דקות
הערה: מסננת התאים מונעת מהפרוסות להישאב לתוך הפיפטה, כדי למנוע נזק לפרוסות.
- מעבירים בזהירות את פרוסות הריאה לצלחת תרבית בת 24 בארות עם מצע תרבית של 500 מיקרוליטר לפחות לשתי פרוסות בכל באר. חשוף את רקמת הריאה לחומרים (ראה שלבים 3.1 - 3.4), למשל, במשך 24 שעות ב 37 ° C, 5% CO2.
הערה: לצורך ההעברה, רצוי להשתמש בלולאת חיסון ולתת לפרוסות לצוף על הלולאה על מנת למנוע נזק לרקמות. אין צורך בהפרדה נוספת של הפרוסות, שכן רק מחסור במדיום טרי מספיק יגרום למוות תאי בפרוסות הרקמה. פרוסות יכולות לחפוף או לגעת זו בזו בבאר: אין לכך השפעה על כדאיות הרקמות.
- הכניסו את כל שאריות החומר האנושי לבקבוק פלסטיק עם חומר קיבוע (למשל, 10% פורמלדהיד חוצץ) למשך 24 שעות לפחות ושרפו אותו בתהליך הסילוק.
זהירות: פורמלדהיד רעיל, בצע שלב זה מתחת למכסה המנוע.
2. הכנת תמיסות לחומרים
הערה: הכן פתרונות עבודה ופקדים מיד לפני השימוש.
זהירות: יש לטפל בחומרים בהתאם להוראות הבטיחות או, אם אינם ידועים, כחומרים שעלולים להזיק ולפעול בהתאם לאמצעי הבטיחות השגרתיים.
- להמיס חומרים מסיסים במים ישירות במדיום התרבית. עבור כימיקלים בלתי מסיסים או לא מסיסים, יש להמיס תחילה את החומר בממסים המתאימים, בהתאם למסיסות החומר. חומרים עם מסיסות מוגבלת במים (<0.1 מ"ג/מ"ל) יכולים להיות מומסים, למשל, בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) או אתנול. ריכוזי ממסים לא רעילים צריכים להיקבע על ידי טיטרציה מראש. ודא שהחומרים אינם מזרזים החוצה מהתמיסה כאשר הם מדוללים למדיום.
הערה: מכינים תמיסות אמוניום הקסכלורופלטינט (HClPt) ונתרן לאורת סולפט (SLS).
- הכינו תמיסות מלאי חומרים בפי 100 מהריכוז הגבוה הרצוי במדיום התרבית או בממס. שוקלים 12.5 מ"ג HClPt ו-34.4 מ"ג SLS ומכינים תמיסות מלאי על ידי המסת הכימיקלים בתרבית 1 מ"ל בינונית.
הערה: אין צורך בממס עבור כימיקלים אלה.
- מכינים דילול סופי של 1:100 בתווך שחומם מראש. במקרה של שימוש קודם בממס, גישה זו מביאה לאותו ריכוז ממס סופי עבור כל ריכוזי החומרים.
- השתמש בריכוז הממס הסופי (למשל, 1% כמתואר בשלב 3.3) לטיפול ייחוס של PCLS. לא נדרשה בקרת ממס עבור הכימיקלים המוזכרים בסעיף התוצאות.
3. הפניות חיוביות ושליליות למבחני ציטוטוקסיות
- עבור כל מבחני הכדאיות, הכינו את הבקרות החיוביות והשליליות הבאות:
- בקרת רקמות: לדגור PCLS בתווך תרבית רק כהתייחסות ל- PCLS לא מטופל במשך 24 שעות בתנאי תרבית תאים (37 ° C, 5% CO2, 100% לחות).
- בקרת רכב (במידת הצורך): יש לדגור על PCLS עם ריכוז הממס הסופי כהפניה ל-PCLS שטופל ברכב בלבד (ראה שלב 3.4) במשך 24 שעות בתנאי תרבית תאים (37°C, 5% CO2, 100% לחות).
- בקרה חיובית: לדגור PCLS עם 1% דטרגנט בתמיסת חיץ למשך שעה אחת ב-4°C.
הערה: אם PCLS הופך חסר צבע, הרקמה מתה. סה"כ L-לקטט דהידרוגנאז (LDH) נקבע בסופרנטנט, עם ספיגה של כ 1.9 - 2.3. הרקמה משמשת לבדיקת WST-1, עם ספיגה של כ-0.
4. מדידת ציטוטוקסיות כימית ב- PCLS אנושי על ידי מלח טטרזוליום מסיס במים (WST-1)
הערה: בדיקת WST-1 מבוצעת בצלחת של 24 בארות עם שני PCLS לכל באר. רצוי, להשתמש בכפילויות עבור כל פרמטר ולאגד את התוצאות של כפילויות אלה לאחר המדידה.
- הכן את פתרון העבודה על ידי דילול מגיב WST-1 במדיום מיד לפני תחילת העבודה. הכמות הנדרשת של פתרון עבודה היא 250 μL / באר של צלחת 24 באר. לכן, מערבבים 25 μL של מגיב עם 225 μL של מדיום התרבות עבור באר אחת.
- לאחר הדגירה של PCLS משלב 1.16, יש להשליך או להשתמש בסופרנאטנט למדידות ציטוקינים או בדיקות אחרות כגון בדיקת LDH. הרקמה הנותרת משמשת לשלב הבא.
- Pipet 250 μL של ריכוז העבודה של מגיב WST-1 לכל באר לדגור את הצלחת ב 37 ° C ו 5% CO2 במשך 1 שעות. ודא כי PCLS מכוסים במלואם על ידי מגיב WST-1 במהלך הדגירה.
- הניחו את הצלחת על שייקר אורביטלי (200 סל"ד) ונערו בזהירות במשך 30 שניות כדי להבטיח ערבוב יסודי של מגיב WST-1. קח צלחת חדשה בעלת תחתית שטוחה של 96 בארות וצינור 100 μL בכפילויות מהסופרנאטנט של כל באר של צלחת 24 בארות.
- מדוד את הספיגה של כל באר ב 450 ננומטר (סימוכין: 630 ננומטר) באמצעות קורא microplate. הפחיתו את הספיגה ב-630 ננומטר מ-450 ננומטר. הערה: נתונים אמינים להערכת ציטוטוקסיות ניתן לקבל רק מרקמה בת קיימא. לכן, יש לעמוד בתנאי הקבלה המתפרסמים בכל ניסוי. אם קריטריונים אלה אינם מתקיימים, יש לחזור על הניסוי
.
- ספיגת הבקרה המדיום הלא מטופל צריכה להיות מעל 0.6, אחרת, יש לחזור על הניסוי. אם הנתונים עומדים בדרישה זו, הגדר את ערך הספיגה של בקרת הרקמה ל -100% וחשב את הפחתת WST-1 של הדגימות המטופלות ביחס לבקרת הרקמות.
